流式细胞仪在动物性别控制中的应用

流式细胞仪在动物性别控制中的应用

性别控制（色情控制）技术是指通过手动干预和操作，根据人类的设计和需要繁殖的性别后代的技术，具有广阔的应用前景。在畜牧领域内,动物性别控制技术可使乳用家畜多产雌性后代,肉用家畜多产雄性后代;在医学领域内,这一技术可减少性连锁遗传病的发生概率。1第3种方法是测定精子的过程中出现的一些重要目前,主要采用3种方法控制哺乳动物的性别:第1种方法是对受精后的胚胎进行性别鉴定,然后移植所需性别的胚胎;第2种方法是通过控制受精环境的一些因素(如母畜生殖道的酸碱性、输精时间等),从而达到抑制某种类型精子(X/Y精子)的活力;第3种方法是分别对携带有X染色体及Y染色体的精子进行分离,然后再对分离后的精子进行人工授精。虽然这3种方法在一定程度上都能达到控制后代性别比例的目的,但第1种方法从严格意义上讲只能被称为性别鉴定(sexidentification),并且这种方法会浪费一半数量的胚胎,此外还需胚胎分割、胚胎移植等相关技术的配合,从而降低了这一技术在实际应用中的可行性。第2种方法在实际应用中虽然操作简单,但由于受各种环境因素的影响使其难以得到精确控制,从而导致试验结果不稳定;同时不同物种对同一处理方法会表现出一定的差异性。第3种方法具有操作简单、试验结果稳定等诸多优点,因而被广泛地应用于哺乳动物性别控制的研究中。目前,国内外有多家公司可提供用于性别控制和已分离的X/Y精液。2流式细胞技术在研究X、Y精子分离的过程中,一些学者依据X精子与Y精子物理特性(体积、密度、电荷、运动性等)的不同,采用免疫学方法、密度梯度离心法、电泳法等方法进行分离。由于这些方法控制性别的准确性较低、重复性较差,目前已很少采用。1986年,Johnson等最早提出可根据X、Y精子DNA含量的不同采用流式细胞技术(flowcytometry)进行X、Y精子的分离,并于1989年首次采用这一技术分离了兔的X、Y精子。此后,应用这一技术相继对猪、牛、绵羊、人等的精子进行了分离。用流式细胞技术分离X、Y精子的原理在于:首先采用能和DNA定量结合的特异性荧光染料(如hoechst33342)对精子进行活体染色;随后将染色后的精子通过流式细胞仪,再由特异性荧光染料经激光激发释放出荧光;由于X精子DNA含量高于Y精子,从而使X精子产生的荧光信号强于Y精子,流式细胞仪可根据荧光信号的强弱分别使X精子、Y精子带上正电荷或负电荷;当携带正负电荷的X精子、Y精子通过高压电场时就会发生偏转,进入不同的收集管,从而达到分离的目的。3不同授精方式、不同授精部位、受精率对受精率的影响目前,采用流式细胞技术分离X、Y精子的研究主要集中在两个方面。首先,由于分离后的X、Y精子价格昂贵,人们试图通过减少单次输精量达到降低动物繁殖成本的目的。因此,许多研究者用不同动物进行试验,以确定在不影响受精率的情况下不同物种受精所需已分离的X/Y精子的最小数量,即所谓的“低剂量授精(lowdoseinsemination)”。其次,人们普遍认为,分离后的X/Y精子受精率之所以低于未分离精子的受精率,可能是由于分离过程使精子受到损伤,从而影响分离后的精子活力。因而,研究者们试图通过优化分离过程达到减小精子损伤、增强已分离精子活力的目的。最新的研究表明,在“低剂量授精”的研究过程中,不同物种甚至同一物种的不同亚种正常受精所需已分离的X/Y精子数量不同。如绵羊15×106个已分离的X/Y精子与50×106个未分离的精子(商业剂量)受精率没有差别。还有一项研究表明,更低数量(1×106)已分离的绵羊X/Y精子与商业剂量(50×106个)未分离的绵羊精子在受精率上没有差别。对于中国荷斯坦奶牛,2×106个已分离的X/Y精子的受精率低于15×106个未分离精子的受精率;而对于安格斯牛,2×106个已分离的X/Y精子与20×106个未分离的精子在受精率上没有差别。在进行“低剂量授精”时,还应考虑不同的授精方式、授精部位对受精率及产仔率的影响。目前,“低剂量授精”方式主要有3种:即通过外科手术将精子注入子宫角、常规人工授精将精子注入子宫体、体视授精(hysteroscopicinsemination)将精子注入宫管结合部。当单次授精的精子数量足够多时,不同授精方式对受精率影响不大;而当单次授精的精子数量较少时,不同的授精方式对受精率的影响很大。MorrisLH等用马的冷冻、解冻后的低剂量精子观察不同授精方式(常规人工授精及体视授精)对受精率的影响。结果发现:当精子数量为14×106个时,不同授精方式对受精率没有影响,受精率分别为67%及64%,差异不显著;而当精子数量为3×106个时,常规人工授精方法的受精率明显低于体视授精方法,受精率分别为15%及47%,差异显著。母畜的生殖年龄对低剂量精子的受精率也有影响。DeJarnette等用低剂量已分离的牛X精子进行人工授精,研究青年母牛及经产母牛妊娠率的差异。结果发现:对于青年母牛,5×106个精子的妊娠率明显高于2.1×106个精子的妊娠率,妊娠率分别为59.5%及46.4%,差异显著;对于经产母牛,两种剂量的精子对妊娠率没有影响,妊娠率分别为52.5%及46.7%,差异不显著;同时不同种公牛来源的精子也表现出一定的差异。母畜的不同发情方式(自然发情及激素诱导发情)对低剂量精子的受精率也有影响。VazquezJM等分别使用70×106个及140×106个流式细胞仪分离的猪精子对自然发情及激素诱导发情的猪进行人工授精。结果发现:不同发情方式对猪的产仔率影响很大,自然发情及激素诱导发情的产仔率分别为25.0%、39.1%,32.0%、46.6%。在进行“低剂量授精”研究的同时,许多学者试图通过优化X、Y精子的分离过程从而达到减小分离过程中精子的损伤、提高分离后精子活力的目的。在采用流式细胞仪分离精子之前,首先要对精子进行高度稀释(8×105个/mL),高度稀释势必会对分离过程中的精子造成损伤,从而影响分离后精子的活力及受精能力。因此,许多学者试图通过在稀释液及冷冻保存液中添加一些保护性物质(20%的蛋黄、一些抗氧化剂、精子膜蛋白异二聚体),从而减小在分离及冷冻过程中对精子的损伤。此外,在流式细胞仪分离精子的过程中,不同大小的分离压也会影响分离后精子的活力。SuhTK等研究了高速流式细胞仪的分离压对分离后牛及马精子活力的影响。结果发现:当分离压分别为30psi(pounds/squareinch)及50psi时,分离后的牛冷冻精子在解冻30min后的活力分别为48.0%及40.5%,解冻2h后的活力分别为40.2%及30.0%,差异显著;当采用30,40,50psi3种大小不同的分离压分离马的精子时,精子的活力分别为40.6%、34.5%、30.1%,差异显著。这一结果提示,在采用流式细胞仪分离精子的过程中,在不影响分离速度的情况下,要尽量采用较低的分离压以减少高分离压对精子造成的损伤。应用流式细胞仪分离精子,其浓度非常低,因而在装管冷冻或输精前要采用离心的方式进行浓缩。早期的研究表明,离心可增加精液内反应性氧的种类,反应性氧对精子膜具有一定的损伤作用,并最终导致精子活力及受精能力下降;最新的研究表明,对分离后的精子采用自然沉淀法进行浓缩可避免上述不利因素的影响。GarciaEM等将用流式细胞仪分离的猪精子分别收集