氨基甲酸乙酯的前体物质

氨基甲酸乙酯的前体物质

氨基乙酸钠（ce，也称为urethan）已经被证明是一种含有致癌物质的药物。世界卫生组织也提议规定酒类饮料中EC的限量标准。美国和加拿大都已经制订了酒精饮料中氨基甲酸乙酯的限量标准。在氨基甲酸乙酯的形成过程中,瓜氨酸是其重要的前体物质。在乳酸菌和酵母菌中的代谢过程中都有瓜氨酸的产生,而瓜氨酸的产生与其ADI酶系的代谢有关。本文通过对黄酒发酵过程中三种氨基酸的检测,研究了黄酒发酵过程中三种氨基酸的变化规律,为进一步的控制黄酒发酵过程中氨基甲酸乙酯的含量做准备。1主要仪器和测定方法菌株:植物乳杆菌。麦曲和酒药取自下沙黄酒厂,发酵参数参考自下沙黄酒厂。主要试剂:精氨酸,瓜氨酸,鸟氨酸,乙酸,α-萘酚,2,3-丁二酮,NaOH,磷酸,二乙酰一肟,茚三酮,均为国产分析纯。水为桶装纯净水。主要仪器:Boxun洁净工作台,上海;精宏恒温培养箱,上海;精宏恒温水浴锅,上海;志威恒温磁力搅拌器,上海;721可见分光光度计,上海;SL-N电子天平,上海;不锈钢压力蒸汽灭菌锅,上海。测定方法:精氨酸的测定方法:参照贺小贤等(2007)的方法;瓜氨酸的测定方法:参照李加友等(2005)的方法;鸟氨酸的测定方法:参照黄爱清等(2005)的方法。2标准曲线的绘制2.1标准的精氨酸曲线在精氨酸含量为0~200μg/L范围内,得回归方程为Y=0.024+0.005X,线性相关系数R=0.995。2.2标准瓜氨酸曲线的绘制在瓜氨酸含量为0-200ug/L范围内,得回归方程为Y=-0.05+0.0075X,线性相关系数R=0.997。2.3标准鸟氨酸曲线的绘制在鸟氨酸含量为0-150ug/L范围内,得回归方程为Y=8×10-5+0.00959X,线性相关系数R=0.999。3在乳液发酵过程中，三种氨基酸的变化3.1植物精氨酸含量的测定在消毒的玻璃缸中,先加入200g经过紫外灭菌的大米,然后加入300g凉开水,按照比例加入5ml培养好的植物乳杆菌培养液(用MRS液体培养基培养),每隔12h测试一次精氨酸,瓜氨酸,鸟氨酸的含量,测试96h。由于浸米阶段大多在四天以内,过长的浸米时间不但会对黄酒的质量产生负面的影响,还会造成设备利用率过低,浸米水中营养损失严重等情况,因此,本实验仅测试浸米4天内的数据。3.2精氨酸的浓度变化3.3瓜氨酸的浓度变化3.4氨基丙烯酸的浓度变化4发酵过程中氨基酸浓度的变化4.1麦曲5g的发酵将200g大米浸泡18h,添加适当水,蒸煮半个小时后,加入10g酒药,置于30℃恒温箱,每隔12h测试一次数据,3天后加入麦曲20g,继续发酵至7d后发酵结束。4.2精氨酸的浓度变化4.2瓜氨酸的浓度变化4.3氨基丙烯酸的浓度变化5讨论5.1大量分解精氨酸和瓜氨酸,总引物的变化由图4可知,精氨酸的含量在24小时候开始迅速升高,在60h的时候达到最高值,随后开始下降。其变化曲线和菌落的生长曲线类似。由于在精氨酸的分解过程中,可以获得能量,因此在后期阶段,菌落开始大量分解精氨酸。从图5可以看出而瓜氨酸的含量则在48h候开始升高,但是相对增长较少,在ADI酶系体系中,瓜氨酸也是中间体,其含量与精氨酸的生成和鸟氨酸的含量有关系。从图6数据,鸟氨酸的含量变化先升高,随后在10~50h阶段,比较平稳,在50h后一直是稳步升高,同鸟氨酸开始增长的时间相符。由于鸟氨酸的含量的上升,可以使得瓜氨酸到鸟氨酸反应减缓,促进瓜氨酸的积累。在黄酒的工业化生产中,有时候会采用回加酸浆水的工艺,从本实验数据可知,在40h内,基本没有瓜氨酸的生成,因此,黄酒生产中浸米时间最好控制在两天以内,不但可以避免营养物质的损失,也可以控制瓜氨酸的生成。5.2麦曲发酵过程中瓜氨酸的变化本实验参考下沙黄酒厂的工艺,先加入酒药,然后在84h加入麦曲,先酒化后糖化。由图7,精氨酸浓度的变化,在酒化发酵阶段(0~84h),是先升高后降低的,在70h的时候,浓度达到最高,随后降低。在加入麦曲后,精氨酸在120h时间点浓度迅速增高至140μg/L,随后维持在比较高的水平,145h候开始下降,此时发酵已经快要结束。根据图8,瓜氨酸浓度变化在酒化阶段和精氨酸类似,先升高后降低,在48h达到最高为7.5μg/L,随后随着酵母菌的衰亡期而降低,而在h后加入麦曲后,其浓度又开始迅速升高。但是在145h的时候,其浓度大为下降,随后增长至9μg/L,在发酵的最后阶段又下降,麦曲是复杂的多种微生物的互相作用的体系,对于其在糖化阶段的变化还不能很好的解释。但可以看出,在酒化和糖化阶段,都有瓜氨酸的生成。在之前的研究中,主要集中于乳酸菌和酵母菌发酵过程中瓜氨酸的代谢,对于麦曲发酵中的瓜氨酸代谢尚待进一步研究。而图9数据显示,鸟氨酸浓度在酒化阶段和糖化阶段都是稳步升高的,并且可以看到,在36h后,和精氨酸一样浓度开始迅速增加。而在84h后加入麦曲后,可以看到增长速度比酒化阶段更快。6乳酸菌和酵母菌的精氨酸代谢体系本实验通过模拟黄酒的发酵条件,研究了精氨酸,瓜氨酸,鸟氨酸在整个黄酒发酵过程中的变化规律。精氨酸在乳酸发酵过程及后发酵过程中浓度随着菌落生长过程先升高后降低,而鸟氨酸在两个阶段的发酵过程中则是浓度一直增高。乳酸菌和酵母菌的精氨酸代谢体系已经研究较为清楚,而麦曲的精氨酸代谢体系尚待进一步的研究。在过去的