wn信号通路与肿瘤的关系

wn信号通路与肿瘤的关系

1982年，自nussse等人发现wnt-1基因以来，发现并克隆了19种wnt基因家族的成员。通过wnt基因指南，确定网络路径为wnt信号路。早期研究已证实Wnt信号途径是一种进化上高度保守、对控制胚胎发育有重要作用的信号传导通路。近十多年来对Wnt基因家族成员的编码产物及其生物学效应的研究发现Wnt信号通路的异常激活参与多种人类癌症的发病,如β-catenin的致癌性突变,或APC的失活性突变,这些突变均可导致Wnt途径的异常活化和各种肿瘤发生。1nt信号通道1.1安全性抑制剂的作用机制Wnt/β-catenin信号传导是一条极为保守的信号通路,利用分子生物学和基因学相结合的手段对Wnt途径进行研究发现Wnt途径的主要组成成员包括:Wnt家族分泌性相关蛋白(Wnt)、跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled,Frz)、辅助性受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein5/6,LRP5/6)、松散蛋白(Dishevelled,Dsh,Dvl)、酪蛋白激酶1(carseinkinase1,CK1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)、结直肠腺瘤性息肉(adenomatouspolyposiscoli,APC)蛋白、轴蛋白(Axin)、β-连环蛋白(β-catenin)、核内转录因子T细胞因子(Tcellfactor,TCF)/淋巴样增强因子(lymphoidenhancingfactor,LEF)家族。其具体过程为(图1):胞膜外配体Wnts蛋白同时与7次细胞跨膜的Frezzled受体和辅助性受体LRP5/6结合后开启Wnt/β-catenin信号通路的传导,并活化胞质内Dsh蛋白,活化的Dsh蛋白能抑制由APC蛋白、GSK-3β、Axin、β-catenin等形成的降解复合体中关键成分GSK-3β的活性,使β-catenin不被GSK-3β磷酸化从而避免了泛素蛋白酶体对其识别和降解,进而在胞质中逐渐积聚。当β-catenin在胞浆中积聚到一定浓度时就开始向细胞核转移,并与胞核内的转录因子TCF/LEFs结合导致β-catenin的下游靶基因的启动因子暴露出来而被激活表达,如激活c-myc、cyclinD1、survin、gastrin、VEGF、ASEF等而导致细胞异常增殖。在正常成体细胞中,胞质内的β-catenin大部分与胞膜粘附蛋白E-cadherin及α-catenin结合形成复合体参与细胞骨架的调节,维持同型细胞的粘附,防止细胞转移,少部分游离的β-catenin在胞浆内被降解复合体磷酸化后由泛素蛋白酶体识别并降解,保持胞内β-catenin低水平状态。显然,β-catenin在这条信号通路中扮演着极其重要的的作用,是整条通路的关键枢纽分子,它由胞浆向胞核的转位被认为是该信号通路被激活后行使功能的标志。1.2分情况下是否独立发挥作用肿瘤信号通路是一个非常复杂的网络系统,大部分情况下并非独立发挥作用。同样Wnt信号通路的在肿瘤形成过程中的传导或转录调控机制是通过和其他的信号通路之间的“通讯”得以实现的。1.2.1smad4/p-smad3/sbes复合材料的制备转化生长因子β(TGF-β)激活TGF-β受体后,被激活的TGF-β受体磷酸化胞浆中限制性通路的Smad蛋白(Smad3),这些蛋白能与公共介质Smad蛋白(Smad4)相结合形成Smad4/p-Smad3复合物异位到胞核,进入核内的Smad4/p-Smad3复合物又和与LEFI/TCF相毗连的SBEs(Smad-bindingelement)结合形成Smad4/p-Smad3/SBEs复合物。Smad4/pSmad3/SBEs复合物可以直接与转录因子LEFI/TCF启动靶基因的转录表达,也可以在β-catenin的参与下和LEFI/TCF结合形成β-catenin/LEF/Smad4/Smad3/SBEs复合物,与Wnt/β-cateinin通路共同激活下游靶基因的转录表达,因此,Wnt既可以独立又可在细胞核内与TGF-β协同调节靶基因表达。1.2.2-catenin物理特征Lamberti等在结肠癌细胞内发现NF-кB通路成员IкB激酶α(IкBkinaseα,IKKα)能增加Wnt信号通路中核内Tcf/Lef/β-catenin复合物的转录活性。同样,Wnt通路中某些成员也参与对NF-кB的调控。Deng等发现大肠癌细胞内的活化游离状β-catenin可与NF-кB结合形成复合物而抑制NF-кB的活性,减弱NF-кB与DNA的结合能力,降低NF-кB信号通路下游靶基因的转录表达水平,如基因Fas和TRAF1。Hoeflich等还发现Wnt通路成员GSK-3β可通过磷酸化NF-кB亚基RelA促进NF-кB核内转移并上调NF-кB对其靶基因的转录激活能力。1.2.3egfr通路结构多条信号通路又可相互交叉通讯,如Wnt信号通路和COX-2信号通路及EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)信号通路之间也存在复杂的信号网络“通讯”。Castellone等在体外结肠癌细胞研究中精确的阐述了Wnt、COX-2及EGFR通路之间的信号网路交叉关系(图2),COX-2的生物活性产物前列腺素2(PGE2)能增强核内Tcf/Lef/β-catenin复合物启动下游靶基因转录的活性,而且还能激活Wnt信号通路某些成员蛋白的信号传递功能,解散“降解复合体”而无法磷酸化β-catenin。PGE2活化Wnt信号通路并非通过PKA-cAMP信号途径,而是通过COX-2通路成员Gαs与Wnt通路成员Axin的直接相互作用得以实现的。Gαs的GTP活性结构区与Axin的RGS(regulatorofGproteinsignaling)区结合后使Axin无法结合到“降解复合体”中,从而激活Wnt信号下游通路。另一重要的发现是,PGE2还可通过EGFR/Akt/PKB(proteinkinaseB)途径对GSK-3β的第9丝氨酸进行磷酸化,使GSK-3β失活而不能磷酸化胞浆内的β-catenin。2wnt基因Wnt途径的异常活化在细胞癌变、肿瘤发生及肿瘤侵袭性过程中具有重要作用,当Wnt基因本身或通路其他任一成员因素发生变化使其不正常活化时,均有可能引起肿瘤的发生。2.1wnt基因表达研究显示,已发现在人类多种恶性肿瘤中存在异常Wnt蛋白信号。Iozzo等通过对100多份正常和肿瘤组织及10个人类肿瘤细胞系的研究发现在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及黑色素瘤中均存在Wnt-5aamRNA的过度表达,尤其是在乳腺癌中的表达异常明显。另外有报告指出Wnt蛋白拮抗剂分泌相关性曲卷蛋白SFRP-1(secretedfrizzled-relatedprotein-1)和SFRP-5的后天性失活与人类乳腺癌症及其预后密切相关。胞内Wnt抑制因子WIF-1(Wntinhibitoryfactor-1)减少或WIN基因的甲基化突变均可诱发食管癌和鼻咽癌及垂体瘤。Queimado等首次在人体涎腺癌细胞中发现WIF1因子表达下调和Wnt1蛋白表达上调。2.2apc基因突变β-catenin基因的突变可避免降解复合体中的GSK-3β和CK1对其磷酸化从而激活下游通路。β-catenin的突变在许多肿瘤的形成中起重要作用。在结直肠癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌细胞中检测到β-catenin突变率高达50%以上,胃癌细胞中β-catenin突变率也近300%。Mikami等在310例早期结直肠癌中发现220例存在β-catenin基因突变。XiaJ等7位日本研究学者在32例基质瘤中有61%(14/23)存在β-catenin第三外显子突变。APC基因是1种与人类许多肿瘤密切相关的抑癌基因,是β-catenin的负性调节因子。APC的突变可导致结肠上皮细胞过度增生形成息肉,并可逐渐恶变成结肠癌。约85%的结肠癌与APC基因的突变或失活有关。Csepregi等在50例肝脏肿瘤中发现有29例(63.1%)存在APC基因启动子甲基化使APC蛋白表达过低。Axin基因作为Wnt信号通路的负性调节因子抑制肿瘤的发生,Axin基因在肝癌细胞中存在较高的突变率,通过直接DNA测序法发现36例肝细胞癌合并肝硬化患者中有9例存在Axin1第3～5外显子基因突变。检测阳性率达25%,24例肝癌细胞中缺乏Axin蛋白或表达水平降低,阳性率高达66.7%。FZD受体的异常表达可见于多种恶性肿瘤,消化道肿瘤细胞中FZD表达明显高于正常粘膜组织,不同胃癌细胞株中就存在FZD家族多个成员的异常表达。To等在12例胃癌标本中检测发现有9例FZD3表达上调。在非小细胞肺癌中也同样发现异常高表达的Wnt7a/Fzd9复合物。Disheveled蛋白是和FZD受体一样,也是Wnt通路的正性调节因子,Dsh蛋白的异常过多表达在一些肿瘤细胞中被检测到。Nagahata等在24例果蝇乳腺癌中发现有13例DVL-1基因异常扩增,其中11例DVL蛋白异常表达。98例人类浸润性乳腺导管癌组织细胞中30%检测到胞浆或核内存在disheveled蛋白异常表达。GSK-3β是通路的负性调节因子,其异常突变或失活可活化Wnt信号通路而引起与肿瘤发生。Farago等设计好一段鼠类糖原合成酶激酶失活激酶KI-mGSK3β(kinase-inactivemurineglycogensynthasekinase3β)cDNA,并将其转然入人类乳腺组织上皮细胞中,随后发现KI-mGSK3β使GSK-3β失活而诱发乳腺上皮细胞癌变。3阻断异常的wnt信号通路对肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡Wnt信号通路的异常活化在细胞癌变、肿瘤发生及肿瘤侵袭性过程中具有重要作用,阻断异常的Wnt信号通路可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。因此Wnt信号通路具有较好的抗肿瘤靶向作用,目前针对Wnt信号通路为靶点的抗肿瘤治疗包括以下几个方面。3.1外源性sfrp抑制剂近年来,随着对抗肿瘤药物曲妥单抗(trastuzumab)的研发成功后,人们对生长因子及其膜外受体的靶点肿瘤治疗研究越发感兴趣。因此,我们可以大胆设想Wnt蛋白本身及其受体可作为肿瘤药物治疗的靶点。已有报告称单克隆抗Wnt-1抗体作用于非小细胞肺癌、乳腺癌、间皮瘤及肉瘤可抑制Wnt配体与胞膜受体结合,引起Wnt通路下游蛋白改变,诱导肿瘤细胞凋亡,且这种单抗体在活体内同样具有抗肿瘤作用。Mazieres等通过siRNA技术和单克隆抗Wnt-2抗体抑制人体恶性间皮瘤细胞Wnt-2蛋白,达到抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。Wnt受体拮抗剂根据作用方式分2类:①直接抑制Wnt配体与FZD受体结合而抑制Wnt信号传导,如分泌型曲卷相关蛋白家族sFRPs(secretedfrizzled-relatedproteins)和Wnt抑制因子WIF(Wntinhibitoryfactor)等;②通过结合LRP5/6抑制Wnt信号传导,如DKK家族(Dickkopf)。sFRPs也属于分泌性蛋白,结构上与富含半氨酸结构域CRD的FZD高度同源,在Wnt信号过度活化时sFRP可结合Wnt蛋白竞争性抑制FZD与Wnt蛋白结合,从而抑制肿瘤的形成和发展并促进细胞凋亡。sFRP基因的甲基化沉默与许多肿瘤的形成有关,将sFRP基因转染入sFRP低表达的间皮瘤细胞株可抑制肿瘤细胞增长,并诱导细胞凋亡。在结肠癌中,同样证实sFRP基因及其表达蛋白的功能复活能抑制Wnt信号通路,即使通路下游的某些成员已经突变。这些研究均表明外源性sFRP能起到有效抑制肿瘤细胞增殖分化作用。WIF通过直接与Wnt蛋白结合而抑制Wnt蛋白活性,阻断Wnt信号的进一步传导。Kim等将包含基因WIF的基因载体转染入人细胞癌细胞株A549和H460中,并将其植入小鼠模型,发现WIF对活体内和活体外肺癌细胞都具有抑制作用。最近正在探讨开发一种具有抗肿瘤潜能的DKK蛋白也是1种分泌性糖蛋白,DKK通过抑制Wnt与辅助性受体LRP5/6结合而抑制Wnt通路。至今,人体内已经确定的DKK蛋白有4种,分别命名为DKK-1、DKK-2、DKK-3和DKK-4。早期的非小细胞肺癌中DKK-3的表达水平明显下调,Hoang等研究发现人骨肉瘤细胞中DKK-3能抑制Wnt通路,诱导β-catenin与粘附蛋白结合,重新定位到细胞膜上,从而有效抑制肿瘤的侵袭性和转移能力。人恶性胶质瘤细胞株U87MG未发现到DKK-1,通过基因处理使其表达适当水平的DKK-1后,再用氮芥和顺铂类化疗药物处理,发现诱导肿瘤细胞凋亡程度明显强于无DKK-1表达组。提示DKK-1可作为化疗药物的辅助药物提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。最近又有报告称DKK-1可降低人类乳腺癌患病率,提示DKK-1可能还起到预防肿瘤的作用。3.2山西气调因子axinWnt信号通路是一条通过胞内许多成员蛋白之间相互作用而向下传导的非直线性通路,其中许多成员是Wnt/β-catenin信号通路中的负性调控因子,发挥肿瘤抑制作用。APC的β-catenin结合区可作为抗肿瘤靶点抑制肿瘤,将重组腺病毒Ad-CBR(arecombinantadenovirus)植入结肠癌细胞(APC突变,野生型β-catenin)后,Ad-CBR阻止β-catenin进入核内,抑制β-catenin与转录因子TCF/LEFs结合,从而抑制细胞生长并诱导其凋亡。Wnt信号通路负性调节因子Axin同样也是抗肿瘤治疗的一个靶点,将载有野生型Axin-1的腺病毒植入伴有APC突变或CTNNB1突变或Axin-1突变的肝癌细胞和结肠癌细胞后,能诱导肿瘤细胞凋亡。最近研究发现,一种丝氨酸-苏氨酸磷酸蛋白激酶(PP1)抑制剂能促进CK1对Axin的某些特定位点磷酸化,使磷酸化的Axin更易于结合到β-catenin降解复合体上,从而促进β-catenin被降解。类似的Wnt信号通路负性调节因子GSK-3β、CK1等理论上也具有抑制肿瘤的作用,或许是未来研究肿瘤靶点治疗的热门领域。3.3胞核转位和方向如前所述,Wnt信号通路中关键枢纽分子β-catenin由胞浆向胞核的转位是该信号通路被激活后行使功能的标志。实验证明,降低胞浆内β-catenin水平及抑制胞浆内β-catenin向核内转移能有效抑制肿瘤。因此,β-catenin是抗癌治疗研究的重要分子靶位。3.3.1抗炎与基因靶向位点的研究近十多年来,反义RNA技术越来越成熟普及化。至今,通过反义RNA封闭靶点基因功能而研发的临床试验药物已超过20种,如bcl-2、c-Myc、H-ras的反义寡聚核苷酸(antisenseoligonucleotides)治疗淋巴瘤、白血病和其他恶性肿瘤。反义寡聚核苷酸是一条人工设计的单链DNA或RNA或DNA/RNA嵌合体,能特异性地与目的mRNA链互补结合,在空间上妨碍以此mRNA为模板的蛋白质合成,在翻译调控水平抑制蛋白表达。反义寡聚核苷酸研发在临床试验中的成功暗示通过反义寡聚核苷酸封闭β-catenin基因转录表达功能同样具有可行性。为此,国内外许多研究学者已证实β-catenin基因具有反义寡聚核苷酸和RNA干涉的靶向位点。Green等发现,反义寡聚核苷酸能阻扰结肠癌细胞β-cateninmRNA功能,降低结肠癌胞浆内β-catenin蛋白表达水平,从而抑制β-catenin进入核内与转录因子结合启动下游靶基因转录,且反义寡聚核苷酸对结肠癌的这中抑制作用呈剂量依赖性。类似的试验在研究食道癌细胞也有相同结果,同样用反义寡聚核苷酸处理5类食道癌细胞系,出现50%以上的β-cateninmRNA功能受限和β-catenin蛋白表达减少。和反义RNA类似,RNA干涉技术(RNAinterference,RNAi)可在肿瘤细胞中通过沉默β-catenin基因达到抑制β-catenin蛋白表达的目的。这几年,一些研究学者已陆续发表过相关文章,进一步证实了通过RNAi技术抑制胞浆β-catenin蛋白表达,从而达到肿瘤分子靶点治疗的抗癌目的。小干涉性RNA(smallinterferingRNA,siRNA)处理的结肠癌细胞株SW480和HCT11648小时后,出现胞浆β-catenin蛋白表达水平明显降低,核内β-catenin/TCF复合物也相应减少,且这种抑制作用可持续10天以上。同样的结果也出现在HeLa细胞株中。GangZeng等将β-catenin小干涉性RNA转染入肝癌细胞HepG2(β-catenin基因突变)和Hep3B(β-catenin基因未突变)后,β-catenin蛋白表达水平明显降低,而且Wnt信号通路下游靶基因如cyclinD1的转录表达也明显受限。尽管类似的结果在活体实验研究报告并不是很多,但利用RNAi技术沉默β-catenin基因发挥有效抗癌治疗作用的潜能非常大。相比较成熟的反义RNA技术,未来生物技术研究RNAi技术还有待进一步提高。3.3.2维持胞内“-catenin库”平衡,激活下游靶基因促进胞浆游离状β-catenin被降解,维持细胞内“β-catenin库”平衡。如前所述,胞内“β-catenin库”平衡被破坏致使胞浆内游离态β-catenin逐渐增多,最终进入核内激活下游靶基因转录表达。因此,促进游离态β-catenin被降解,减少胞浆内活化状β-catenin,维持胞内“β-catenin库”平衡,从而抑制β-catenin进而核内激活下游靶基因转录,发挥抗癌治疗作用。Cong等通过人工设计,将E-cadherin的β-catenin结合区整合入一嵌合蛋白融合成β-TrCP泛素蛋白连接酶,再将此蛋白植入DLD1结肠癌细胞株中,发现胞浆内游离态β-catenin被泛素蛋白酶体泛素化和被降解率明显增高,DLD1细胞克隆增生也明显受限,且在随后的裸鼠试验中能抑制肿瘤生长。SU等设计了包含多个APC蛋白第15位氨基酸重复单位的嵌合体F蛋白盒(CFP),将此蛋白盒植入结肠癌细胞后发现,胞浆内游离β-catenin不需经降解复合体磷酸化便可被泛素蛋白酶体发现并降解,提高了β-catenin的降解率,抑制其进入核内激活下游靶基因转录。近来有研究报告称,钙周期结合蛋白(calcyclin-bindingprotein,CacyBP)能降低胃癌细胞胞浆和核内β-cateni