加味桃核承气汤及其拆方对糖尿病损伤人脐静脉内皮细胞培养液中pa和pai-1含量的影响

加味桃核承气汤及其拆方对糖尿病损伤人脐静脉内皮细胞培养液中pa和pai-1含量的影响

以往的研究表明，加味桃核承气汤对糖尿病及其心血管并发症的预防和治疗发挥了一定的作用。为了探讨该处方对血管病变的影响，我们采用了血清药理学和细胞培养方法。观察了该处方及其合著者对人体肚脐静脉内皮细胞（huvec）——在高葡萄糖和高胰岛素破坏环境下，组织类纤维溶酶原激活物（tpa）和plam-1（plam-1）的影响。结果如上所述。1材料和方法1.1材料分离、培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)取自健康产妇顺产新鲜脐带,无菌取材,运输液保存,冰袋冷藏取回实验室立即进行分离,原代培养后传2～3代用于实验。1.2内皮细胞生长添加物罗格列酮由葛兰素史克(天津)有限公司生产(批号:04090081);细胞培养液:基础培养液M199(LifeGIBCO,美国)加入2.0g/LNaHCO3、0.292g/LL-谷氨酰胺、3.0g/LHepes、10mL/L双抗液(100倍);完全培养液[不含内皮细胞生长添加物(ECGS)]:M199基础培养液+体积分数为20%胎牛血清(FCS);完全培养液(含ECGS):M199基础培养液+体积分数20%FCS+0.03g/LECGS;造模培养液:M199基础培养液+体积分数20%FCS+0.03g/LECGS+20mmol/L葡萄糖+300mU/L胰岛素;ECGS(LifeGIBCO,美国);胶原酶(LifeGIBCO,美国);tPA、PAI-1试剂盒(上海太阳生物技术公司)。1.3实验动物中心采用清洁级SD雄性大鼠,体质量180～220g,购买并饲养于广州中医药大学实验动物中心(合格证号:0004897)。基础鼠料总热量6.94J/g(质量分数:蛋白质23%、碳水化合物53%、脂肪5%)。1.4药物处理及-不同浓度标准药液加味桃核承气汤(桃仁10g、大黄6g、桂枝6g、甘草3g、芒硝6g、黄芪30g、生地15g、麦冬12g、玄参12g)及其拆方称量分组为加味方高、中、低剂量组,活血组(桃仁10g、桂枝6g、熟大黄6g),泻热通下组(大黄6g、甘草3g、芒硝6g),益气养阴组(黄芪30g、生地15g、麦冬12g、玄参12g),原方组(桃仁10g、大黄6g、桂枝10g、甘草3g、芒硝6g)。将每组药物(不含芒硝)用相当于药材量5倍的自来水浸泡2h,武火煮沸后文火煎煮30min,过滤后收集煎液,加入芒硝,搅拌充分溶解。原渣再加水煎煮20min,过滤取煎液。两液相混合,于水浴恒温器上浓缩至5g/mL。1.5多次给药和血样采集大鼠灌胃药物为加味桃核承气汤及其拆方、罗格列酮(4mg);每日灌胃2次(早晚相隔12h),连续给药3d。末次灌胃1h后采血(摘眼球法)。血样静置3h以上,待血块收缩良好后,1500r/min离心15min;无菌吸取上层血清;灭活;加入硫酸汞、叠氮钠,充分混匀;0.22μm微孔过滤器滤过除菌;分装,-20℃保存。1.6理论等效剂量及实验结果取经纯化及鉴定后的HUVEC分10组:正常组,模型组,罗格列酮(阳性对照)组,加味方高、中、低剂量组,活血组,泻热通下组,益气养阴组,原方组。正常组和模型组均加入空白大鼠血清;加味方中剂量组所用药物血清的供体大鼠灌胃量由我们前期实验成果决定,即大鼠理论等效剂量是人的单位体质量剂量的5.75倍。因药物血清的稀释度为5,所以单位体质量大鼠每次灌胃估计量为人的单位体质量剂量的28.75倍。加味方高、低剂量组所用药物血清的供体大鼠灌胃量分别为前者的2倍和1/2倍;各配伍组所用药物血清的供体大鼠灌胃量按加味方中等灌胃量计算而得。1.7细胞培养板密度选取长满培养瓶底约80%的HUVEC进行传代,细胞计数,以1×104/孔用造模培养液接种于96孔培养板,每孔体积200μL,共分9组,每组12孔(测tPA、PAI-1各6孔),另用普通培养液接种1组12孔(测tPA、PAI-1各6孔)正常培养细胞。置于体积分数为5%CO2、37℃培养箱中培养1h,添加大鼠血清(空白血清或含药血清),培养12h,取样检测。1.8-1吨/升采用酶联免疫吸附双抗夹心法原理定量测定培养液中tPA、PAI-1水平。1.9统计处理数据结果采用SPSS11.5统计软件包进行处理。数据方差齐者采用随机方差分析;数据方差不齐者采用秩和检验。2罗格列酮对血清tpa、pai-1含量的影响表1结果显示,模型组与正常组比较,tPA含量有降低的趋势,但无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,活血组tPA含量增加(P<0.05),罗格列酮组亦可见这一改变(P<0.01)。模型组较正常组PAI-1含量显著性升高(P<0.01);与模型组比较,加味方中、高剂量组,活血组,泻热通下组,原方组及罗格列酮组PAI-1含量均显著性降低(P<0.01)。3对血管内皮功能的影响血管内血液流变学、血流动力学因素与血管内皮正常功能密切相关,而tPA和PAI-1对此起着重要作用。糖尿病(DM)并发血管病变的机制极为复杂,血管内皮细胞功能的改变是其病理生理改变的重要环节。由血管内皮细胞分泌的tPA和PAI-1共同调节纤溶酶的活性,DM患者tPA/PAI-1平衡失调提示血管内皮功能受损,导致了DM血管并发症的发生与发展。本实验结果显示,与模型组比较,活血组、罗格列酮组可促进tPA含量增加,但模型组与正常组比较,tPA含量无显著性差异,提示胰岛素、葡萄糖可能不是通过tPA影响血管内皮功能,具体机制有待于进一步研究证实。另一方面,模型组较正常组PAI-1含量显著性升高;与模型组比较,加味方中、高剂量组,活血组,泻热通下组,原方组及罗格列酮组PAI-1含量均显著性降低,而且加味方高剂量组、活血组、泻热通下组、