myod基因在3个黄牛品种中遗传多态性分析

myod基因在3个黄牛品种中遗传多态性分析

我的肌腱特征d最初是mio1，于1987年首次克隆。这是mrf的一个成员（我的d、mrf5、我的obg和mrf4）之一。MyoD基因不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化，而且能把许多种类型细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞等)转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维，在成肌过程中起主导作用。现代肌肉发育生物学的研究表明，脊椎动物肌肉的生长潜力即肌纤维的数量在出生前就已决定，出生后数目不再改变，出生后肌肉的生长主要靠肌纤维长度和周径的增大，而肌纤维的增粗又会影响肌肉的嫩度，从而影响其肉用品质，由于MyoD基因的重要功能，近年来，它成为动物肉质改良育种的重要研究内容。在牛上的研究也逐渐兴起。牛MyoD基因位于15号染色体，DNA共有2648bp，有3个外显子，2个内含子。田璐等、黄萌等报道中原黄牛MyoD基因的第2内含子及第3外显子上发现与胴体性状密切相关的多态位点，但其他位点尚未见报道。因此本实验以MyoD基因的第2外显子及第1外显子编码区部分序列为研究对象，利用PCR-SSCP技术对我国西南地区3个地方品种黄牛———盘江牛、昭通牛及巴山牛的遗传多态性进行了研究，以期为我国南方黄牛的选育提供新的理论依据。1材料和方法1.1保肝活性碳的制备采集西南地区部分牛品种共136头，其中，巴山牛56头（重庆荣昌），盘江牛41头（贵州关岭），昭通牛39头（云南昭通）耳组织1g置于75%酒精中，用冰盒带回实验室，-20℃冷冻保存。1.2方法1.2.1提取各组dna采用酚-氯仿法提取组织DNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度及浓度。1.2.2pcr扩增nd基因根据GenBank(gi:119947342)登录的牛MyoD基因序列，用Primer5.0软件设计引物，引物P1、P2分别扩增MyoD基因的第2外显子全部序列和第1外显子编码区部分序列。扩增片段大小分别为319bp和256bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列为：1.2.3pcr反应条件PCR反应体系为20μL：其中包括10×PCRBuffer2.0μL，上下游引物(20pmol/L)0.5μL,TaqDNAPolymerase(5U/L)0.2μL,DNA模板(50～100ng/L)1.0μL,dNTP(2.5mmol/L)1.6μL，加ddH2O至20μL。反应条件:94℃预变性4min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s，进行33个循环；72℃延伸10min后4℃保存，产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.4聚丙烯酰胺凝胶法2μLPCR产物加入8μL的变性上样缓冲液(98%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚兰)，然后98℃变性10min后，迅速插入碎冰中，放置5min。样品在预冷的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Act:Bis=29∶1)中电泳。140V电压电泳过夜，电泳结束后，进行银染显带并记录结果。1.2.5延长产物的测量序列选取纯合基因型个体，对其PCR产物进行纯化，送上海英骏生物公司测序。1.2.6基因型频率的确定基因频率和基因型频率的计算。基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。Pi为第i个等位基因的频率；i为纯合复等位基因；j1,j2,……,jn为与i共显的第1到第n个等位基因基因型频率指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于PCR-SSCP方法的检测结果为共显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率。基因型频率=基因型个体数/测定群体总数Hardy-Weinberg平衡检测：Ei为理论值Oi为实际观察值n为等位基因数。2多态性分析经PCR-SSCP分析发现，在所扩增的2个片段中，第1外显子编码区部分序列出现多态性，扩增的第2外显子部分序列未发现多态性，故只对第1外显子编码区部分序列进行分析。2.1up-pcr扩增用所设计的引物对不同牛品种的基因组进行扩增，引物的最佳退火温度为58℃，在此温度下，扩增出MyoD基因的第1外显子编码区部分序列，片段大小为265bp左右。所得PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的目的片段明亮、特异性好（见图1），可用于后续实验。2.2pcr-scp检测结果经SSCP分析，第1外显子存在单核苷酸多态，出现AA、BB、AB3种基因型。结果见图2。2.3aa基因型的结构对MyoD引物P1扩增的2种纯合子基因型AA和BB进行测序，结果表明：AA基因型的碱基序列与GenBank(gi:119947342）的序列一致，而BB基因型在782处有一个G→A的突变(图3)，并导致了氨基酸的突变，使甘氨酸改变为丝氨酸。2.4盘江牛和山所有权的基因型频率特征由表l可见，在3个牛品种中，都检测到了AA、AB和BB基因型，而且A等位基因为3个牛群体的优势等位基因，频率较高。3个品种中，盘江牛AA基因型频率最高，达到0.5365，而巴山牛和昭通牛则相对较低，分别为0.4465和0.2564。经过X2适合性检验，3个群体中X2值分别为1.282(P>0.05）、0.107(P>0.05）和0.264(P>0.05），证明盘江牛、巴山牛和昭通牛群体的MyoD基因第1外显子编码区部分782处G→A的突变均达到了Hardy-Weinberg平衡状态。3讨论3.1我国西南地方黄油基因的分布格局MyoD基因是肌肉转录因子家族的重要成员，位于肌分化基因的上游，具有很强的肌肉转化能力，目前已成为众多研究的焦点。MyoD基因在肉质性状改良方面也引起了人们的重视，在猪上研究较早，在牛上研究尚处于起步阶段。田璐等、黄萌等研究了牛MyoD基因第2内含子和第3外显子区域多态位点，但其它位点尚未见报道。本实验选取MyoD基因的第2外显子及第1外显子编码区部分序列，利用PCR-SSCP技术对我国西南地区地方黄牛的遗传多态性进行了研究，结果在我国地方黄牛第1外显子上发现了新的等位基因，并证明此位点的突变在盘江牛、巴山牛和昭通牛3个群体中均达到了Hardy-Weinberg平衡状态，这种分布频率的原因可能与品种产生历史有关。我国南方黄牛多分布在山区及深丘地区，这些群体在各自相对封闭的环境中自然繁育而成，其基因分布相对比较平衡。后续实验中我们将采集南方地区更多的地方牛品种，扩大研究的单位群体的数量，使研究更加准确。3.2猪肉色及肌肉性状的基因序列家畜的产肉性能与肌纤维的数量和生长有着密切的关系。肌卫星细胞的增殖和分化可以影响个体的肌肉生长速度和产量，故MyoD基因的结构变异可能会影响一些与肌肉相关的生产性状。Knoll等报道，猪的MyoD内含子1有1个DdeIPCR-RFLP位点，MyoD的A突变基因具有使肌纤维生长更充分，肌纤维变粗，面积增大的作用。A基因还具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积，降低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴体长度等提高胴体品质的效应，但A基因也会导致肉质的劣变。朱砺等对MyoD基因在不同猪种中的PCR-RFLP遗传多态性及其遗传效应的研究中得到了类似的结果。TePas等的研究表明,猪高水平的MyoG,Myf-5和MyoD的mRNA表达，可以作为选择较高水平增长率的一个指标。另外，在对瘦肉率进行选择的过中，MyoG与MyoD的比率也可以作为肉色与肌纤维组成比率的指标。田璐等分析了基因位点多态性与肉牛肉质性状的相关性，表明实验群体不同基因型对肉牛的宰前活重、胴体重、净肉重、高档肉重、眼肌面积等性状的影响差异极显著或显著，并且AA型个体均高于AB型个体。黄萌等发现MyoD基因C1867T位点3种基因型对肉牛的背膘厚、大腿肉厚的影响差异极显著或显