啤酒酵母菌的诱变选育

啤酒酵母菌的诱变选育

细胞蛋白（cp）是指以各种生化过程为基础的，作为人类食品和动物饲料的蛋白质来源的菌、细菌、放线菌、真菌、藻类、高等真菌和其他微生物的干物质。细胞蛋白的生产原则本质上是通过工业模式培养微生物。随着人口的增加和生活水平的提高，人们对动植物的需求只能满足于植物。细胞蛋白的生产是解决蛋白质缺乏的重要措施之一。与动物蛋白质相比，细胞蛋白具有以下优点：（1）由于气候、地理等条件的限制；（2）快速生长和繁殖；（3）土壤和水的含量很高。（5）废物利用。本实验从赣州市酒厂废弃的啤酒糟中分离出啤酒酵母菌,并对其进行紫外诱变,经过初筛和复筛,筛选出蛋白质含量较高的啤酒酵母菌株,从而确立了高产蛋白酵母菌的紫外诱变的模型,为今后筛选高产菌株奠定了基础.一方面,此菌株由于其单细胞蛋白含量较高,所以在饲料加工业有很大的应用前景;另一方面,也可以做到废物利用,净化环境.1材料和方法1.1马铃薯葡萄糖培养基实验菌株产朊假丝酵母(Candidautilis)A(华中农业大学提供);啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)B(本次实验从啤酒糟中分离).培养基马铃薯葡萄糖培养基(A):马铃薯16.1%,葡萄糖1.7%,水80.6%,PH自然;马铃薯葡萄糖培养基(B):马铃薯16.1%,葡萄糖1.7%,琼脂1.6%,水80.6%,PH自然;酪蛋白培养基:Na2HPO4·12H2O0.13%,KH2PO40.035%,NaCl0.0097%,ZnSO4·7H2O0.0019%,CaCl2·2H2O0.00019%,酪素0.39%,酪素水解氨基酸0.0049%,琼脂1.95%,PH7.21.2方法1.2.1啤酒酵母菌的纯化啤酒酵母菌的分离称取经发酵的啤酒糟诀废弃物1.0g,置入99mL生理盐水的锥形瓶中,内装有玻璃珠,振荡20min,即成10-2的稀释液,继续稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌悬液.用无菌移液管分别取上述三个稀释度溶液0.1mL,依次滴加在已制备好的无菌马铃薯葡萄糖培养基平板上,用涂布棒涂布均匀,接种后,将平板倒置于30℃恒温培养2d,观察实验结果.啤酒酵母菌的纯化根据啤酒酵母菌的分离的实验结果,用接种针挑取10-6稀释度的菌落,用划线法接种到马铃薯葡萄糖培养基斜面上,30℃,恒温培养2d,用同样的方法,连续纯化4次.通过镜检,得到较纯的啤酒酵母菌菌落.1.2.2生长曲线测定往150mL液体马铃薯葡萄糖培养基中加入经纯化的1%啤酒酵母菌液,30℃下,120r/min振荡培养,每隔1h取样4mL,用752型光栅—分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光值,以空白的液体马铃薯葡萄糖培养基为对比,取满24h后,停止取样,根据所得数据作出生长曲线图,找出对数期.1.2.3不同诱变剂量的确定菌悬液的制备往100mL液体马铃薯葡萄糖培养基中加入已纯化的啤酒酵母菌液1mL,30℃,120r/min下振荡培养12h,吸5mL液体离心洗涤2次,取菌体沉淀至45mL生理盐水中,充分混匀,即制成菌悬液,诱变前用血球计数板在显微镜下直接计数,将其稀释至细胞浓度为108个/mL.紫外线诱变处理取8mL菌悬液移入直径为9cm且带有磁力搅拌棒的无菌培养皿中,置于磁力搅拌器上,20w紫外灯下(波长253.7nm),30cm处分别照射0s、30s、60s、90s.稀释涂平板在黑暗(红灯)下分别取未照射(作对比)和照射过的菌悬液各0.5mL,进行不同程度的稀释,取最后三个稀释度10-4、10-5、10-6的菌悬液各0.1mL,每个稀释度涂3个平板,30℃下,倒置,避光培养2d,观察结果,计算致死率.高产菌株的筛选(1)初筛.用接种针挑取经不同剂量诱变的直径较大菌落,稀释至10-3,取10-2、10-3两个稀释度各为0.1mL,滴加到酪蛋白胨培养基平板上涂布均匀,倒置,30℃下恒温培养2d,测量平板上出现的透明圈直径.根据透明圈直径的大小,选出各诱变剂量下,蛋白酶活性较高的菌落,转接到马铃薯葡萄糖斜面上培养,留待复筛;(2)复筛.将初筛选出的菌株接种于马铃薯葡萄糖培养基中,培养12h后,再接种在已灭菌的啤酒糟中,在温度为30℃条件下,分别培养4h,8h,12h.而后用KDN-04定氮仪测定具有一定质量、不同培养时长的啤酒糟中蛋白质的含量,根据蛋白质含量的大小,筛选出蛋白质含量较高的酵母菌株.2结果2.1菌落直径.生长特性酵母菌在固体培养基表面形成的菌落一般都是湿润、较光滑、呈乳白色、有一定的透明度、容易挑起.正反面边缘,中央部位的颜色比较均一、单调.根据菌落直径的大小,可粗略判断菌落的优劣.平板上菌落直径见表1.由表1知稀释度为10-6时,其菌落直径普遍比其它要高.所以选取菌落直径为2.8cm的菌落接种斜面,以待纯化.细胞的观察(1)细胞形态:多数为单细胞球形、椭圆形等,有的具假菌丝;(2)细胞大小:细胞直径或宽度为2～5μm,长度为5～30μm;(3)菌落形态:较大、厚光、滑、粘稠、易挑起、乳白色、少数红色.2.2系数生长曲线及菌液诱导处理的确定供诱变处理的细菌一般要求处于对数生长期,此时群体生长状况比较同步,易变异,重复性较好,同时为了保证处理时具有一定的细胞浓度,以增加可变异的细胞总数,故选用对数期的细胞进行处理.由图可知,对数生长曲线为8～16h,20h后进入稳定期,故选择已培养了12h的菌液进行诱变处理.2.3诱变剂量的确定本实验采用紫外线照射对啤酒酵母进行诱变处理,致死效果见图2.图2显示,在紫外灯功率和照射距离保持不变时,照射时间越长,诱变致死率越高.本实验选用诱变剂量为30s、60s、90s.2.4紫外诱变剂量的确定初筛酪蛋白培养基主要用于初步测定酵母菌的蛋白酶活性.一般来说,透明圈越大,蛋白酶的活性越高;透明圈越小,蛋白酶的活性越低.由表2可得知,当诱变剂量为60s时,培养基上所出现的透明圈直径比未经诱变和其它诱变剂量的普遍更高.根据资料也同样表明致死率为80%左右时,诱变效果较好.表2同时也表明,紫外诱变是不定向的,随机的.本次实验从经诱变剂量为0s、30s、60s、75s、90s.诱变后的菌株各选一株,斜面培养,以待筛选.其名称分别取为UV0、UV30、UV60、UV90.复筛结果从表3中可以看出,随着培养时间的增加,当发酵8d后,蛋白含量基本上不再发生变化.根据表中数据对不同菌落多产生的蛋白质含量进行比较,发现诱变剂量为60s的菌株UV60其样品中蛋白含量最高为18.89%,比空白样品中蛋白含量增加了13.64%,比未经过诱变的菌落其样品中蛋白含量提高了3.05%,比优良饲料酵母菌株样品提高了2.59%.连续传代3次,其样品中蛋白含量均为18.9%左右,性能稳定.所以,菌株UV60蛋白含量最高,为实验所需菌株.通过本次实验发现,啤酒酵母菌经过紫外诱变之后,发生突变,当诱变剂量为60s时,温度为30℃,啤酒酵母菌长势以及样品中蛋白质含量比其它诱变剂量都要高.3诱变育种的研究新的微生物菌种决定着微生物代谢产品,但菌种的生产能力高低,则决定着微生物产品的开发和生产前景,因此,微生物的诱变育种是极其重要的环节.目前,单细胞蛋白啤酒酵母的研究工作国内外报道较多,但主要集中在配方和生产工艺上的研究,对于单细胞蛋白啤酒酵母的诱变育种国内还未见报道,因此本实验的研究对于提高单细胞蛋白的产量寻找了一条新的有效的途径.然而至今,诱发突变还不能进行理性的控制,而是随机的,尤其在对新菌种及其代谢产物的生物合成途径和调节机制还不清楚