牛羊超数排卵方法的研究进展

牛羊超数排卵方法的研究进展

超数抗卵（超数抗卵）可以诱导大量成熟的卵，增加移植胚胎的数量，这对动物育种中起着重要作用。同时，它也是研究动物生产和动物克隆的基本手段之一。目前家畜的超排主要用于牛羊，以使用FSH或PMSG为主。也有人在试验通过抑制素免疫进行，效果明显，但超排个体反应差异较大，这一问题目前仍无法解决。本文就牛羊超排方法的研究进展进行综述，以使人们对超排有更多了解，促进超排方法的改进，超排效果的提高。1局部的超排处理初级卵泡经过征集、选择、优势化，而发育到可排卵阶段，其间绝大多数卵泡（如反刍动物99%以上）的命运是闭锁退化。超排处理就是降低发育卵泡的闭锁率，增加早期卵泡发育到高级阶段的数量，是一个连续的动态过程，这一过程受中枢神经系统、垂体前叶和卵巢间激素调控。超排处理常见的方法有：(1)降低或消除卵巢对促性腺激素释放的负反馈反应，这主要针对FSH，如进行抑制素免疫。(2)增加外源激素，提高血液中促性腺激素浓度。生产中较多采用后者，而且常与刺激内源促性腺激素释放的方法结合进行。1.1fsh剂量的确定以发情当天为0d，在发情周期的适当时间，即卵泡波发生时（12～13d或17～18d），开始肌注或皮下注射FSH，以递减剂量或恒量连续注射3d6次或4d8次，即每天2次，间隔12h。FSH总剂量按牛、羊的体重、胎次作适当调整：羊一般为150～300IU，牛略高。FSH注射完后随即进行试情。1.2肌注hcg200在发情周期的适当时间（发情周期12～13d或16～18d），羊一次性肌注或皮下注射PMSG800～1500IU，出现发情后或配种当天肌注hCG500～750IU。牛按每千克体重5IU左右确定PMSG的总剂量，在注射PMSG后48h和60h各肌注PG一次，剂量0.2～0.4mg，在出现发情后12h即第1次输精的同时肌注抗PMSG。2民事成本低，易导致应激目前，困扰超数排卵效果有2个主要因素：超排反应变异范围大和黄体早期退化。与FSH相比，PMSG省时、省力、成本低，但有副作用；FSH虽然副作用小，但要求多次注射，较麻烦，对供体造成的应激较大，成本也较高。针对这些问题，人们主要就如何在最大程度发挥PMSG、FSH作用的前提下，尽可能减少或消除它们的缺点做了较多的探索改进。2.1大量应用pmsg的安全性因素PMSG是最初在山羊的胚胎移植的科研和生产中广泛应用的超排激素，早在1983年，Armstrong就曾用PMSG对山羊进行超排，一次注射750～1250IU，平均获胚10.8±1.2个。1985年Durant给山羊一次注射PMSG500IU，取得了同样的效果。但是用PMSG超排时，由于PMSG半衰期比较长，且具有FSH和LH两重作用，因此大量应用PMSG处理时会带来一些副作用，如：容易造成卵巢肿大，不排卵的卵泡增多，使雌二醇(E2)分泌增多造成胚胎发育早期，外周血中高E2水平，形成不利于早期胚胎发育的雌激素主导的子宫环境。使发育中的胚胎质量下降，并能使黄体早期退化，而使胚胎回收率下降。Pintado等(1998)于撤去孕酮阴道栓前第36h注射1000IUPMSG，在撤栓后的第28h静脉注射PMSG抗体，得到的可用胚数比对照组(仅用PMSG)几乎增加1倍(5.75:2.75;p<001)。但排卵平均增加不明显，可能是个体差异的原因。Saharrea等(1998)在山羊发情开始后84h给予hCG，有力地阻止了PMSG超排引起的黄体早期退化。但试验表明,用FSH进行超排处理在排卵率、受精率、优质胚产量上要优于PMSG。因此,现在生产中已经较少使用PMSG进行超排，一般使用FSH。2.2fsh和pmsg的超排效果此法是将同期发情和超数排卵结合在一起的方法，是目前使用最多的牛羊超排方法。其具体操作是给供体在阴道内放入第1个CIDR10d后取出，同时放入第2个CIDR,5d后开始注射FSH，或给供体放入第1个CIDR后9～10d开始注射FSH，连续递减剂量注4d8次，在第7次注射FSH时取出CIDR，并同时注射PG，一般取出CIDR后24～48h发情。Amstrong的试验中，用FSH处理山羊后平均排卵数为16.1±0.8个，显著高于一次性注射PMSG处理后的平均10.8±1.2个。Kiessling等(1986)对奶山羊进行了FSH和PMSG超排对比试验，FSH超排获得胚胎数为17(n=2)枚，明显超过了PMSG处理组获得的2(n=2)枚。因此近年来，此种方法的应用较PMSG要多。FSH的超排效果虽然优于PMSG，但因其半衰期短，必须进行多次注射才能起作用，程序繁琐。为了简化FSH的注射程序、降低动物的应激反应，有人将其溶于大分子聚合物聚乙烯吡咯酮(PVP)中，进行1次性的肌肉注射。由于PVP是大分子聚合物，用其作为FSH的载体，和FSH混合后注射，可使FSH缓慢释放从而延长FSH的作用时间，一次性注射FSH即可达到超排的目的。研究表明，FSH制剂用PVP溶解进行一次注射超排时，其在母牛体内的半衰期可延长到大约3d，而溶解在盐水中的FSH半衰期仅为5h左右。Smith等（1973）最早将此法用于肉牛的超排，以后许多学者对此方法进行了研究和改进。Yamamoto等将30mgFSH溶于10mL300g/LPVP中，一次肌注对牛进行超排获得良好效果。曾培坚（1997）报道，分别用7.5mg(中科院动物所生产)、250IU、300IU(武汉生物制药厂生产)FSH溶于10mL15%PVP中进行一次性注射超排绵羊，头均获胚分别为5.0、4.67和5.0枚。李键等用30%PVP溶液稀释FSH后一次注射总剂量超排处理波尔山羊与FSH递减法多次注射对比，分别获得可用胚22±1.0枚和19.0±11.1枚，差异不显著。试验表明，将FSH溶于PVP载体中一次注射，可用于家畜的超排，但PVP的最佳分子量和浓度等，有待进一步试验研究。2.4发情周期的fsh作预处理Waer等在发情后的第2d或第3d给青年母牛10mgFSH作预处理，随后在11～16d再进行总量为35mgFSH正常处理，结果预处理青年母牛平均排卵3.5枚，对照组为2.1枚。Rejamahendran等在发情周期的第3d和第4d给予2.5mgFSH作预处理，结果比正常FSH程序回收到的卵子多（P<0.05），每头母牛回收的优质胚胎增加1.6枚。但Lussier等（1989）试验表明排卵数并未提高。一般供体牛在放入CIDR后第9d开始注射FSH进行超排。耿繁军等在放入CIDR的同时肌注5mg17β-E2后的4d后就进行超排，结果获得可用胚数和A级胚胎数与一般方法差异不显著，但使超排全过程时间缩短，相应的在胚胎移植过程中受到天气变化等不利因素的影响程度减小，可操作性相对增强。2.6外源性fsh对fshs人工模型的影响王志刚等（1999）用He-Ne激光照射穴位结合外源性FSH处理牛，增加了胚胎数和可用胚胎数，试验组头均胚胎数比对照组多2.2枚，头均可用胚数比对照组多1.9枚,差异显著。2.7超排使用fsh的必要性Gong等(1996)在青年母牛上，用重组的牛生长激素(rbGH/rBST)增加了有腔卵泡(2～5mm)的数量，增强了对eCG的超排反应，胚胎回收的最终结果显示，rbGH预处理显著提高了母牛的排卵数、胚胎回收率与可移植胚数量，可用胚率明显增加。另外，卵巢囊肿等排卵反应差现象发生率显著低于对照组。在绵羊上，Joyce等(1998)发现，用FSH超排处理前使用生长激素(rGH)启动的预处理方法，改变了产雌激素大卵泡IGF(类胰岛素生长期因子)系统，使卵巢上中等大小的卵泡生理性成熟度及数目增加，但未改变排卵率反应。Akinlosotu等(1993)对山羊用FSH进行超排时，在发情开始时给予一定量的GnRH可以减少胚胎回收时不排卵大卵泡数量的出现，结果不但提高了胚胎质量,而且提高了可移胚数和受孕率。Fry等(1999)在牛的试验中报道:超排时，用促性腺激素刺激72h后，给予一定量的GnRH大大增加卵巢上d≥5mm的卵泡数量，提高了超排效果。桑润滋等在牛发情输精同时注射LRH，结果可用胚率比对照组高21.6个百分点，差异极显著。也有人采取PMSG和FSH相结合的方法，用PMSG代替部分FSH进行超排处理。岳奎忠等(2000)于第1次注射FSH的同时，加注PMSG200IU。超排母羊的平均红体数为13.94±1.11个，平均获卵10.59±0.97个，获卵率为78.20%，显著超过了单纯使用FSH处理。Pintado等(1998)用PMSG替代部分FSH，获得了和单纯使用FSH一样数量的可用胚，大大降低了超排的成本。2.10疫羊两组小鼠统计结果比较有人尝试用人工合成的抑制素免疫法对羊进行超排试验。Wheaton等（1992）用高度纯化的抑制素抗血清主动免疫绵羊，排卵率较对照组提高3.3倍。桑润滋等（2000）也用抑制素免疫母牛，并结合纯化FSH，超排结果，试验组头均胚胎数和头均可用胚数分别比对照组增加2.4枚和1.4枚。大量的事实表明,供体进行抑制素免疫后，所产生的抗体中和了外周血浆中的抑制素，减弱了其对垂体的负反馈作用，从而使FSH分泌增加，促进卵泡发育并提高了排卵率。3激素超排技术应用同一种超排方法，不同的个体之间超排结果差异较大，除了个体本身的因素外，激素的应用也起着很大的作用。激素剂量过大，卵巢上发育的卵泡数和排卵数量过多，会导致卵巢体积的异常增大和卵子接受过程的机械障碍，经输卵管伞接受到的卵子数量却有限。剂量不足，则达不到预期的超排效果。杨梅等(2003），桑润滋等(2003）等多人对激素的最佳剂量进行了研究，但由于激素的生产厂家、生产批号不同，供体的状况也有差别，因此不能得到统一的标准。Moor等(1984)提出，激素制剂中FSH/LH的比例在刺激卵巢反应中起着重要作用。Amstrong等(1984)用FSH/LH比例最低的FSH制剂对绵羊和山羊进行超排，结果超排率和胚胎产量提高。激素注射途径的不同也影响着供体的超排反应。在羊上，肌注LH或hCG时，促排反应慢且排卵同期化较差；而静脉注射时，激素作用快，羊排卵同期化好，而且静注比肌注激素用量要少。俞颂东等(2002)报道激素肌注部位选在臀部的效果明显好于颈部。供体超排后配种时是否需要注射hCG或LH促进排卵，对此看法尚不一致。Hafez认为，成年母牛、绵羊和山羊不需要外源性LH或hCG。王光亚也同意这种观点，他的试验显示，山羊超排后能表现发情，内源性的LH足以诱导大多数卵泡的排卵，增加外源性的LH似乎不能提高超排效果。但也有大量的报道称在超排时注射LH或hCG可提高超排效果。本实验室曾对此进行了研究，表明在肉羊配种时注射LH，使血液中LH浓度增加，可以增加获胚数，减少未排卵