核糖核酸的功能及应用

核糖核酸的功能及应用

糖核酸（rn）通常存在于动物、植物和微生物细胞中，这与蛋白质的生物合成密切相关。微生物来源的RNA及其降解产物核苷酸在医药、食品、保健品及农业等领域均有重要的应用价值。20世纪60年代,日本开始研究通过培养富含RNA的酵母来生产RNA,经过不断改进培养方法,目前酵母发酵生产RNA的工艺已相当成熟。我国莆田糖厂利用富含RNA的酵母工业化连续发酵生产RNA,菌体RNA含量可达到菌体干重的14%~15%,年产量达到200吨。我们主要综述利用富含RNA的酵母发酵制备RNA的研究进展及其应用。1rn的使用1.1辅助保护大鼠肝损伤模型大鼠的相关指标核酸可作为保健品,能够有效提高机体的免疫力。动物实验表明,在日粮中添加酵母核酸,能有效降低嗜水气单胞菌感染的病死率,同时增加动物的食欲和体重。刘阳等通过肝损伤模型大鼠试验发现,核酸口服液能降低血清丙氨酸转氨酶、血清天冬氨酸转氨酶含量,减轻病变肝脏组织的气球样变和胞质凝聚,表明核酸对肝损伤模型大鼠有辅助保护作用。姜桂荣等通过对55例高血脂症患者的核酸膳食治疗,发现核酸膳食对降低高血压、高血脂,改善动脉粥样硬化病效果十分明显。国内外许多核酸保健品已经上市。1.2磷酸腺苷atp目前工业上生产核苷酸的一种可行方案就是以酵母RNA为原料,经酶解后分离纯化得到4种单核苷酸,再进一步酶法合成可得到相应的衍生物胞苷二磷酸(CDP)胆碱、S-腺苷甲硫氨酸和尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖等。核苷酸是生物体内重要的低分子化合物,除作为DNA、RNA的前体,也作为生理、生化过程的调节物质参与体内物质代谢。最新研究表明,作为心肌梗死抢救药物和冠心病预防用药的三磷酸腺苷(ATP),能完全中止阵发性室上性心动过速(PSVT)患者的PSVT症状;外源性的ATP还具有抗肿瘤增殖和诱导细胞凋亡的功能。三磷酸胞苷(CTP)具有激活和促进受损伤神经组织(包括周围神经)再生和修复的能力,能有效治疗突发性耳聋和糖尿病外周神经病。鸟苷酸能赋予食品鲜味,主要与肌苷酸和谷氨酸一起用作增强食品风味的食品添加剂。在单核苷酸的基础上可合成相应的衍生物,这些衍生物同样具有重要的生理功能。尿苷酸经UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化合成的UDP-葡萄糖,一方面可作为寡糖、多糖等生物合成的糖的供体;另一方面其单糖结构部分经转化或修饰后,成为各类糖类生物合成的中间体。利用固定化细胞法可催化ATP转化为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。作为甲基供体和生理性巯基化合物,SAM参与胞内许多重要的氧化还原反应,它不仅控制肝细胞的生长,还能调节肝细胞的凋亡,能选择性诱导肝癌细胞凋亡,同时保持正常肝细胞的生长,在肝癌防治方面具有很高的研究价值。可作为治疗脑意识障碍和脑昏迷抢救药物的CDP-胆碱,我国每年需进口40吨,而ATP每年需进口50吨才能满足国内市场的需要。利用酵母发酵得到大规模的RNA原料来生产核苷酸及其衍生物,具有很高的研究价值和广阔的市场前景。2采用发酵法制备钠2.1活性酵母生产rna不同微生物细胞内的RNA含量差异较大(表1),通常在细菌中RNA含量为5%~25%,在酵母中为2.7%~15%,在霉菌中为0.7%~28%。其中,热带假丝酵母RNA的含量较高,一般在8%以上。在一些发酵液和其他生产废液、废渣中通常有一些富含RNA的菌体,如从味精生产废液中的菌体和啤酒酵母中可提取RNA产品。乔宾福利用芽孢杆菌发酵法生产分泌型RNA,该方法能有效简化RNA提取分离步骤,但尚未见工业化生产的报道。在啤酒酵母中RNA含量可高达6%~8%,至今以废啤酒酵母提取RNA作为生产RNA的有效途径被广泛采用,其具有工艺简单、成本低等优点,但收率较低,核酸产品在质量和产量上都不能满足市场的需要。利用培养富含RNA的酵母来生产RNA的工艺,具有如下优点:(1)酵母菌体中RNA含量普遍高于其他微生物,且大大高于DNA含量,RNA/DNA达到29.6;(2)酵母菌体较易收集,且RNA提取容易;(3)能够得到大量纯度高、浊度低的优质RNA;(4)酵母可以连续培养;(5)酵母培养容易,对培养基的要求极低;(6)提取RNA后的脱核酵母可作为优质的蛋白饲料。2.2采用低表面活性剂发展的突变株RNA含量高的酵母菌多属于假丝酵母。假丝酵母属(Candida)是能形成假菌丝、不产生子囊孢子的酵母。不少假丝酵母能利用正烷烃为碳源,其中氧化正烷烃能力较强的假丝酵母多是解脂假丝酵母(C.lipolytica)或热带假丝酵母(C.tropicalis)。这些含有高RNA的酵母一般都具有筛选标记,或为染料耐受突变株如ATCC20007,或为钾敏感型突变株,具体的分子机制尚不清楚。Shunichi等筛选了一系列假丝酵母,发现对钾敏感型突变株核酸含量均较高,并且以正烷烃作为惟一碳源时,菌体的干重和RNA含量均有明显提高。李祥鹏等利用亚硝基胍处理热带假丝酵母Y-17菌株后得到诱变株RB-40,诱变株利用正烷烃为碳源,在100mL摇瓶中培养时,其RNA含量从5.5%提高到8.8%;再用亚硝基胍处理得到氯化钾敏感株K7,其RNA含量能达到11.6%。2.3丰富的钠发酵技术利用富含RNA的酵母发酵提取RNA,是生产RNA的有效途径。为得到RNA生产的最佳工艺,须进行一系列的筛选与培养工艺优化。2.3.1培养基及细胞的活性根据酵母菌体生长所需的不同营养成分来选择合适的培养基组分及配比,对菌体内核酸含量的提高具有重要的意义。Shunichi等分别利用甘油、乙醇、豆油、乙酸和正烷烃作为碳源培养假丝酵母,发现以正烷烃作为惟一碳源时,菌体的干重和RNA含量均有明显提高。盛建国等分别以原糖液、糖化液和废糖蜜作为碳源培养热带假丝酵母K-79株,发现以原糖液为碳源时RNA含量最高为8.6%。周震等利用2%的葡萄糖培养热带假丝酵母QZN0209株,RNA含量达到13.9%。氮源的代谢物能够为菌体生长和RNA积累提供氨基酸和核苷前体,工业上多用玉米浆和酵母膏作为有机氮源,以尿素或(NH4)2SO4作为无机氮源。磷是微生物进行平衡生长的限制因素之一。在无机磷过量存在的情况下,胞内DNA、RNA和蛋白质的量增加,呼吸速率上升。李祥鹏等在利用6L发酵罐培养热带假丝酵母K-79株时,认为培养基中最重要的元素为氮和磷,并且必须有锌和铁等微量元素。当培养基中加入0.3%的磷酸时,酵母RNA含量能达到13.9%;而当磷酸含量只有0.15%时,酵母RNA含量只有10.8%。通过摇瓶正交试验,周震等也发现培养基中对核酸含量影响最大的是KH2PO4,其次是葡萄糖。酵母细胞中嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成分别需要谷氨酰胺、天冬氨酸直接参与,实验证明加入0.3%的谷氨酰胺可使RNA含量提高30%。由于微量元素与酵母的活动密切有关,它们或是酶活性基的成分,或是酶的激活剂,所以在培养基中要加入适当浓度的镁、锌和铁等微量元素。2.3.2酵母rna的积累一般来说,菌体生长越快,其个体越大,RNA含量也越高,且其中大部分是核糖体RNA,每个细胞RNA随生长速率的变化可达10倍之多,在快速生长的细胞中RNA的含量可以达到细胞重量的30%。在发酵过程中,须在对数生长期终止培养,以得到高的核酸含量。酵母发酵生产RNA为好氧发酵,溶氧对RNA含量影响较大,酵母在氧气充足的情况下细胞分裂增殖迅速,能维持高的生长速率,同时能避免产生对酵母生长不利的乙醇。培养温度的上升,能使酵母比生长速率增大,RNA含量升高,但同时酵母细胞加速衰老,自溶也增加,在温度为32~33℃时对酵母RNA的积累最为有利。李祥鹏等通过培养工艺优化,得到了培养热带假丝酵母K-79株的最佳条件,即pH值为4.5,培养温度控制在32~33℃,溶氧不低于20%饱和度,接种量0.5~1.0g(菌体干重)/L,搅拌速度为1000r/min,补料液在4h内流加完毕,整个培养过程在6h内结束。在此工艺条件下酵母细胞浓度达到20~25g(菌体干重)/L,RNA含量为13%~14%。福建莆田糖厂在此工艺基础上,采用12m3气升式发酵罐、连续发酵工艺,发酵液稀释率维持在0.66/h左右,菌体干重维持在11~12g/L,RNA含量达到14%~15%,RNA年产量大约为200吨。2.4破壁方法的提取国内关于从酵母菌体提取RNA的研究较多,多与啤酒酵母的综合利用相关。酵母RNA提取主要分3步进行:(1)破壁,使核蛋白从细胞中溶出;(2)除蛋白,使杂蛋白变性沉淀;(3)离心,使核酸与蛋白分离,得到RNA清液,再调RNA等电点,使RNA粗品沉淀,经纯化、干燥得到成品。破壁方法有机械破壁、化学破壁和酶法破壁等多种,现在研究应用较多的为化学破壁法,包括浓盐法、稀碱法和氨解法等。影响提取效果的主要因素有酵母和化学试剂的浓度、提取时间和温度等,其中由于在30~70℃时胞内RNA酶活力较强,故要迅速加热至90℃以上以避免RNA降解。比较浓盐法和稀碱法提取酵母RNA的工艺,发现浓