细胞水平的高通量筛选技术研究进展

细胞水平的高通量筛选技术研究进展

随着生命科学的快速发展，特别是功能诱导、蛋白质组、代谢组、细胞组、组合化学和联合生物合成等新领域的启动，潜在药物作用的目标数量和所需活性物质的数量显著增加。这些进展为高通量药物筛选提供了良好的条件,同时也对高通量筛选的效率提出了更高的要求,不仅需要更大的筛选规模和筛选速度,同时也要求筛选模型的检测技术能够更快速、全面反映被筛样品的生物活性特征。细胞水平的高通量筛选比分子水平的筛选更能适应以上需要。标准的体外分子水平筛选技术具有快速、微量的特点,筛选结果准确,稳定,易于评价,但其检测模型只能做到对特定靶点的单指标检测,提供化合物对靶点作用的有限信息,无法对化合物的生物活性进行综合评价。因此,单纯的分子水平的高通量药物筛选技术已不能满足新药发现的需要。而细胞水平筛选涉及完整细胞,其在活细胞自然条件下研究药物对生命体功能的影响,接近体内的生化过程,可以比较准确地了解药物的生物学特性,提供生物相关信息,并可通过一次试验获得多个参数的高内涵信息。笔者主要就目前细胞水平的高通量筛选技术进展情况作一介绍。1细胞水平高通量筛选技术目前这方面的进展有如下几个方面:①微量化,超高通量化:到2000年止,国外大多数的制药公司细胞水平的筛选已经至少达到了1536孔板的规模。尤其是对于荧光方法,目前有报道可以达到3456甚至9600孔。应该说微量化技术是实行超高通量筛选(uHTS)的基础。但随着检测体积的减少,对载体微孔板硬度和加样自动化精度要求越来越高,同时对检测系统和数据分析系统也提出了更高要求。②均质检测:所谓均质检测是指采用一步加入策略,尽可能省去过滤,离心和冲洗等繁琐的难于自动化的步骤。③多指标、多靶点,多通道检测:多指标,多靶点,多通道是现今细胞水平高通量筛选技术的核心和关键。而光显微荧光成像技术是进行多指标检测的基础。通过多指标、多靶点检测有助于发现药物作用的新途径,深入认识药物作用的机制。另外也为筛选具有互补的多靶点作用机制的单一治疗药物提供了手段和工具。④实时动态检测和可视化:通过对活细胞进行荧光标记,利用先进的荧光成像技术,可实现对研究对象的分子水平的实时动态检测和可视化研究,并可进行自动图像分析和数据量化分析。2流场细胞技术细胞水平筛选体系常用技术包括分子克隆和表达,报告基因系统,荧光标记检测,离子流检测,荧光影像技术和微量化技术,这些相关技术系统的快速发展无疑推动了细胞水平筛选技术的发展。到目前为止,靶向细胞因子、生长因子、离子通道和G-蛋白偶联受体(GPCR)在细胞水平上的功能性检测中都取得了成功的进展。2.1以整合性的基因为依托,不通过重组基因的定位重组技术是细胞水平高通量常用技术手段,经典的方法是通过重组基因在宿主细胞基因组的随机整合而产生稳定细胞株。这种重组技术的不足之处在于重组基因的定位不可预测,表达水平受重组位点的影响,基因拷贝数不确定,阳性克隆的产生率低,筛选时间长等。而采用游离体载体(episomalvector)克服了上述不足,转染效率高,阳性克隆筛选速度快。2.2gfp及其受体基因检测该技术是将靶基因连接到细胞上,通过激活或抑制靶基因导致报告基因的表达,再通过比色、荧光或发光的方法进行检测。目前报告基因技术应用更加简便,如荧光素酶(luciferase)和β-半乳糖苷酶报告基因系统,不需裂解分离可直接均质检测。目前活体细胞应用较多的报告基因是绿色荧光蛋白(GFP),因其适于活体细胞检测,被称为生物传感蛋白。它的优点是具有自发荧光,不需其他的底物和辅因子且荧光稳定,另外GFP与其他蛋白嵌合后不影响其自身荧光特性。GFP及其变体作为报告基因适用于实时动态研究体内或细胞水平的蛋白定位和转位,蛋白的降解,蛋白-蛋白的相互作用,细胞骨架动力学,细胞周期,并可检测目的基因表达变化。目前常用的报告基因还有β-内酰胺酶,文献报道通过其水解荧光能量共振转移(FRET)底物CCF4/AM来进行定量检测,或作为核因子调节的指示蛋白,常用于受体功能筛选。2.3荧光特性的提高在细胞筛选中使用荧光技术,不仅可定量读取荧光密度,还可在单次实验中同时获得其他的荧光特性,如荧光寿命,极化,淬灭,提高筛选的有效性,可快速、多参数的评价样品和靶之间的相互作用。2.3.1荧光标记物法fpFP是分析生物体系中分子间相互作用的一种技术,它可以根据荧光标记的小分子在游离和与大结合分子靶标2种状态时的极化荧光值不同而加以区分。FP的最大优点是不用分离游离的荧光标记物,整个反应在均相溶液中进行,且检测时间不会影响结果,具有高灵敏性、高稳定性和可重复性的特点。该方法操作简便,假阴性或假阳性率低,是一种理想的研究方法,可用于细胞水平的膜受体如GPCR、核受体调节剂的HTS筛选。有报道Linda等采用该方法用于促肾上腺皮质激素2α亚型受体(CRF2αR)的功能分析中cAMP的直接检测。2.3.2荧光底物fretFRET是指非放射性能量在适当能量给予体和接受体之间转移。当给体激发态能量满足光学和空间上的要求时,其能量能有效转移给受体,导致受体发射荧光。而随着给体和受体空间距离的变化能显著影响能量的有效转移效率,利用这一原理可进行荧光底物设计和人工合成,并用于分子间相互作用分析。目前细胞筛选常用的β-内酰胺酶(β-lactamase)报告基因检测系统采用的荧光底物就是基于FRET的原理,化学合成底物CCF4,为一分子头孢菌素联上一分子7-羟基香豆素和一分子荧光素(fluorescein)。当体系无配基激活时,底物完整,激发香豆素导致发射530nm绿光,如加入研究受体的特异性配基,报告基因系统激活,表达β-lactamase,底物被β-lactamase裂解,破坏了FRET,激发香豆素发射460nm蓝光。如有文献报道将其用于GPCR受体-催产素受体(hOTR)的筛选。另有文献报道采用FRET原理设计淬灭型底物进行激酶的筛选。2.3.3受体分离和相助-配体相分离TREF是一种双标记方法,其原理是在长寿荧光镧系复合物和共振能量受体之间的长范围能量传递。TREF是在液态条件下进行的,不需固定相支持和分离步骤,也不需对试剂进行特殊处理。其优点是通过减少背景,使长期存在的供体和受体信号随时间显示很高的敏感性。目前广泛用于蛋白与蛋白结合分析、受体配体结合分析等。Hugo等利用长寿荧光金属铕作供体成分,用另一个荧光分子XL665(一个改型别藻蓝蛋白的片断)作为受体进行了β-分泌酶抑制剂的细胞水平筛选。2.4荧光相关成像检测细胞系统的优势涵盖高内涵筛选技术、共聚焦显微成像技术、荧光相关光谱技术等。2.4.1高内涵筛选(highcontentscreening,HCS)所谓高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下,同时检测被筛样品对活细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响,最大特点是可在单一实验中获取大量相关信息,确定样品生物活性和潜在毒性。高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统,在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术,旨在获得被筛样品对固定化或动态细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。高内涵筛选技术的检测范围包括:靶点激活、细胞分裂及凋亡、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导,还可用来监测细胞器、活性物质释放(一氧化氮、活性氧、胞内钙离子)等。目前,HCS技术被广泛应用于药靶的证实和药物初筛,尤其适用于诸如GPCR功能性研究,药物多靶点研究,癌症的综合研究,多指标形态学观察,激酶级联反应,信号转导途径的研究等。Gurwitz等采用HCS对细胞水平的17种蛋白同时进行了检测。其中,CellCardTM系统是一种新的多通道(multiplexed)HCS筛选技术,由VitraBioscience公司开发,可在96孔板单孔中实现对多个细胞系或多靶点的同时检测,是一种基于多通道的全自动影像系统。该系统可在单一检测中应用多参数检测,可定量单一细胞类型中多个细胞内事件或对多个细胞类型实行同一检测,在获得样品活性的同时得到样品对不同细胞株上设计的不同靶点的选择性信息。该技术关键点为先进的CellCardCarrier微载体技术,允许多种细胞株在96孔板的同一孔中进行生长并检测。CellCard的优点是增大了检测容量,提高了检测数据质量,节省了时间,降低了成本。但该系统对细胞培养的要求很高,培养环境必须适合所有被检细胞株生长。2.4.2共聚焦显微成像技术(fluorescenceconfocalmicroscopeimaging)共聚焦显微成像技术采用共聚焦激光微扫描,并结合数字化影像和光稳荧光染料,特别适合于微量,快速的细胞水平生物分子的多荧光标记检测,活细胞和亚细胞影像分析和多维成像。共聚焦显微光学系统如EVOscreen系统,能够做到均质检测,检测体积小而不损失信号质量。目前利用共聚焦的荧光技术有荧光共振能量转移(FRET),荧光寿命显微成像(fluorescencelifetimeimagingmicroscopy,FLIM),光漂白后荧光复现FRAP(fluorescentrecoveryafterphotobleaching),光漂白荧光损失FLIP(fluorescencelossinphotobleaching),FCS(fluorescencecorrelationspectroscopy)等。2.4.3荧光相关光谱(fluorescencecorrelationspectroscopy,FCS)FCS是一种超高通量筛选检测技术,该技术通过共焦镜提供高聚激发光,消除背景可做到单分子检测,其共聚焦光学系统使得对输出信号的微量化分析成为可能,FCS可评价单个分子的荧光信号,提供荧光粒子的扩散特征信息,可进行多参数,多维荧光检测。FCS能用来监测分子结合时的相互作用如进行受体结合分析和其他分子事件。OLEG等报道了采用FCS用于活细胞筛选GPCR调节剂,在3456孔板,最小测活体积小于2μL。2.4.4FLIPR(fluorescentimagingplatereader)FlIPR96和FLIPR384是由MolecularDevices公司开发的针对活细胞荧光检测钙流的技术,由于检测荧光信号快速、准确,可达到亚秒级水平,允许短暂信号的检测,尤其适用于钙指示剂检测胞内钙。FLIPR同样是一种均质、动态、细胞水平的荧光检测方法,可用于胞内钙离子、钠离子、膜电位和pH的检测,但因为靠水冷的氩激光提供激发能量,用冷的CCD成像系统检测,受到光源限制,目前应用较多的染料为Fluo-3/AM和calciumgreen。2.4.5FMATTM(fluometricmicrovolumeassaytechnology)是由PEBiosystem开发,基于荧光发光团Cy5,以红色的633nm氦/氖激光为光源的多孔板扫描技术,可以有效扣除背景,具有较好的检测灵敏度,也是一种均质的活细胞检测技术。FMAT技术可以应用在细胞因子调控表达,GPCR,核受体,蛋白-蛋白相互作用,蛋白-核酸相互作用的功能性测定研究中。此外还有应用FMAT技术改良的ELISA一步法的FLISA技术。除上所述,细胞水平新的检测技术还有Biosignal公司的amplifiedluminescentproximityhomogeneousassayscreen(AlphaScreenTM)技术,Amersham公司和ImagingResearchInc共同开发的LEADseekerTMHomogeneousImagingsystem,用来取代放射性的亲和闪烁分析(SPA)适合的检测,其灵敏度比SPA高10倍,SurfacePlasmonResonance(SPR)技术,CLIPRsystem(ChemiluminescenceImagingPlateReader)技术,还有纳米颗粒偶联生物分子也被用在细胞水平的超敏生物学检测中。3细胞水平的结构-检测前已述及,细胞水平的筛选技术在受体功能研究中应用广泛,以GPCR受体功能研究为例,目前应用广泛的Transflour®技术,其适用于各种GPCR(Gi,Gs,Gq,G12/13)受体功能研究,其原理为不同的GPCR受体与配体相互作用时激活特定的G蛋白Gα亚单元,并导致相关的下游信号的级联激活。而此过程中,均涉及一个胞浆衔接子(adaptor)蛋白Arrestin,其在几乎所有的GPCR受体脱敏过程中发挥作用,Arrestin蛋白从胞浆转位至胞膜与受体结合形成复合体,随后GPCR受体和其特定G蛋白解偶联导致受体脱敏。此外Arrestins蛋白还介导受体的胞浆内化并与之结合,内化受体或形成颗粒状蛋白散布于胞浆中,重新循环发挥功能(Resensitization)或在溶酶体中降解。因此利用Arrestin蛋白的转位,结合和内化,将报告基因和Arrestin蛋白表达成融合蛋白,可作为GPCR受体功能研究的指示蛋白,用于细胞水平的高通量筛选。该方法的优点是动态直观,可量化,易操作,且避免了以往GPCR受体研究中因不同的受体亚型激活特定的信号通路而需要设计不同的筛选方法,特别是其适用于无配基的孤儿核受体的功能研究。如Richik等利用报告基因GFP和Arrestins蛋白表达成融合蛋白的稳转U2OS细胞系进行加压素受体V2R的高内涵筛选研究。Yu等利用报告基因β-半乳糖苷酶的两个互补片段分别结合GPCR受体和Arrestins蛋白用于细胞水平的β2肾上腺素受体和CXCR2趋化因子受体筛选。除此之外的细胞水平GPCR受体筛选方法仍有诸多报道,如前已述及的检测钙流的FLIPR技术,检测信号分子环磷腺苷(cAMP)水平采用基于FP和BRET原理的筛选方法等。我国天然产物资源丰富,特别是中药有效成分具有多靶点的作用特点,可充分发挥现今细胞水平筛选多指标同时检测的独特优势,新的细胞水平筛选方法在天然产物活性筛选和评价中得到了充分应用。如Ausseil等利用细胞水平的生物发光检测技术,采用人直肠癌细胞系稳定转染分子靶标4