冠心病血瘀证与一般血浆中的蛋白组分析

冠心病血瘀证与一般血浆中的蛋白组分析

冠状动脉硬化是一种严重危害人类健康的常见疾病。它的发生与脂质代谢障碍、血管内皮细胞损伤、单核细胞移植和切下致切物细胞分离以及mcclovac细胞的形成、细胞坏死和脂质积累有关。血瘀证是冠心病的常见中医证型,活血化瘀是治疗冠心病的常用方法。先前通过的血液流变学、微循环和分子生物学等方法对冠心病血瘀证进行了大量的实验与临床研究,对揭示证的实质起到了重要作用。蛋白质组学是一种新的研究手段,蛋白质组是指由一个基因组、一种生物或一种细胞/组织表达的所有蛋白质。蛋白质组研究的技术路线主要是高通量双向电泳进行蛋白质的分离,再用专业计算机软件进行图像分析,然后通过质谱技术及蛋白质数据库信息对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定。由双向电泳、质谱、计算机图像数据处理组成的蛋白质组学的技术体系具有高通量、高分辨率和高重复性的特点,能对微量样品进行全面自动定量分析,并在疾病诊断物的发现、药物作用靶标、安全性评价、耐药性机制、疾病动物模型研制和中医药现代化等方面得到应用。而应用于临床诊断的疾病标志物应该是容易获取并易于随时检测的,正是基于这样的考虑,我们采用蛋白质组学技术比较正常人与冠心病血瘀证病人血浆中的蛋白质差异,以期发现冠心病血瘀证病人血浆中的诊断标志物。1数据和方法1.1诊断标准的制定选择2003年10月—2004年2月住院的冠心病血瘀证病人8例,均符合WHO/ISEC1979年制定的《缺血性心脏病的命名和诊断标准》及中国中西医结合活血化瘀研究专业委员会1986年制定的血瘀证诊断标准,年龄55岁~65岁。正常健康人(对照组)8例,为本院健康查体者,年龄54岁~65岁。1.2培养液、胎牛血清及去蛋白试剂IPG缓冲液、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等双向电泳试剂均购自Amershampharmacia公司;DNA和RNA酶购自Sigma公司;蛋白质酶抑制剂、胰酶购自Roche公司;二甲基甲酰胺、赖氨酸购自Roche公司;蛋白质定量标准考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250购自Amresoco公司。DMEM培养液、胎牛血清购自GIBCO公司,肿瘤坏死因子(TNF-α)购自Sigma公司。去除白蛋白试剂盒购自Pierce公司。仪器为Amershampharmacia公司蛋白质学研究配套仪器:IPGphor等电聚焦仪,EttanDALTsix双向垂直电泳仪,MultiTempⅢ温控循环水浴,ImageScanner扫描仪,Imagemaster2DElite图像分析软件,Imagemaster2DDatabase数据库软件,Typhoon9410扫描1)本课题为北京中医药重点学科项目,北京中医药“125”人才培养计划项目仪,DecyderDifferentialin-gelAnalysisVersion4.00.06和BiologicalVariationAnalysis图像分析软件。1.3理论血浆蛋白样品,进一步扩大血浆相对于人体的覆盖面取1mL抗凝血液,4℃放置30min后,离心(3000r/min,15min),取上清转移至Ep管,离心(7500r/min,30min),取上清,从8份血浆样品中各吸取100μL血浆合并,得到正常人和病人血浆蛋白样品。1.4抗白蛋白抗体从血浆中去除白蛋白:加抗白蛋白抗体株到离心管中,然后加380μL双蒸水作用20s,离心(12000r/min,1min),弃去洗脱液。加80μL血浆到离心管中,与抗白蛋白抗体反应1min,离心(12000r/min,1min),收集洗脱液,将洗脱液再加到离心管中,再次与抗白蛋白抗体反应1min,离心(12000r/min,1min),收集洗脱液。加50μL缓冲液到离心管中,与抗白蛋白抗体株反应1min,离心(12000r/min,1min),收集洗脱液。将洗脱液合并,得到去除白蛋白的血浆蛋白样品。1.5ndad染色将蛋白质定量标准(Albuminstandard)梯度稀释后用考马斯亮蓝G-250染色,波长595nm测定吸收度,做标准曲线,样品稀释100倍测定蛋白质浓度。1.6ipg胶条的等电聚焦分别取正常和TNF-α处理细胞的蛋白质制成第一向等电聚焦体系。采用胶内泡涨方法,样品和泡涨液(8mol/L尿素、2%CHAPS、20mmol/LDTT、0.5%IPG缓冲液、痕量溴酚蓝)共450μL,揭下IPG胶条的保护膜,胶面向下,先将IPG胶条尖端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中,慢慢下压胶条,并前后移动,避免生成气泡,最后放下IPG胶平端,使溶胀液浸湿整个胶条,从IPG胶条两侧加入ImmobilineDryStrip覆盖油,盖上盖子。将胶条槽放置于等电聚焦上,注意电极接触良好,设置等电聚焦参数:30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,1h;8000V,8h(pH3~pH10),8000V,10h(pH4~pH7),8000V,12h(pH6~pH9)。最后选择等电参数8000V,10h(pH4~pH7)。1.7第二次平衡过程IPG胶条平衡2次,每次15min。平衡缓冲液包括6mol/L尿素和30%甘油,可减少电内渗,有利于蛋白质从第一向转移到第二向的转移。第二次平衡步骤中加入260mmol/L碘乙酰胺,以除去多余的DTT。平衡后的胶条用去离子水润洗后,将胶条的边缘置于滤纸上几分钟,以除去多余的平衡缓冲液。将IPG胶条小心地放置于第二向制好的SDS胶上,并轻压使IPG胶条与SDS胶充分结合,注意胶面之间不能有气泡,用0.5%琼脂糖封顶,进行双向电泳,双向电泳参数为80mA,40min,调至120mA,到溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘结束电泳。1.8蓝、甲醇、10%冰醋酸染色考马斯亮蓝染色液(0.1%考马斯亮蓝、50%甲醇、10%冰醋酸)染色6h,考马斯亮蓝脱色液(25%乙醇、8%冰醋酸)脱色12h。1.9碳酸氢铵溶液选取2D胶上存在明显差异的蛋白质点,用刀片沿斑点染色边缘切下蛋白点置于1.5mLEp管中,用含50%乙腈和25mmol/L碳酸氢铵溶液脱色,胶片真空离心干燥。加4μL胰酶,37℃保温18h,加入5%三氟乙酸120μL于40℃保温1h,合并上清,加入2.5%三氟乙酸和50%乙腈溶液120μL于30℃保温1h,并发上清液冷冻干燥。1.10氟乙酸质谱仪μL三氟乙酸溶解样品,取1μL点靶,另取1μLα-腈基-4-羟基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸,50%乙腈的饱和溶液作基质,室温干燥。质谱仪采用激光波长337nm,反射检测。质谱峰用Bruker的肽段标准或胰酶的自切峰(MH+:906.505Da,1020.504Da,1153.574Da,2163.057Da,2273.160Da)进行标定。1.11数据库中寻找和筛选蛋白质数据库检索程序根据输入的蛋白质等电点、分子量范围及肽质量指纹谱数据和其他一些参数在数据库中寻找与这些参数相匹配的蛋白质。检索参数为①种属选择人;②胰酶酶切;③可变修饰选择氨基甲酰化和氧化;④漏切点选择1;⑤肽质量标准差选择0.3;⑥单同位素质量。2结果2.1冠心病血红蛋白点的变化分别将正常健康者和冠心病心血瘀阻证病人的除去白蛋白的血浆蛋白质,进行三次双向电泳,第一向用pH为4~7,长度为24cm的预制胶条,第一向结束后进行SDS电泳,图像分析时将正常人血浆的凝胶选铁参考胶,其他胶与参考胶相匹配,蛋白质点经标准化后输出数据到Excel进行统计分析。正常人和冠心病血瘀证病人血浆的双向电泳凝胶上的蛋白质点的个数分别为256±11、273±12。冠心病血瘀证血浆蛋白质中改变的蛋白质点可通过统计而得到。因为与疾病有关的蛋白质在3次实验中均表现为上升或下降,如果一个蛋白质点在3次实验中有时上升有时下降,这可能是因为样品制备、双向电泳等原因引起,这样的蛋白质点暂不考虑,以排除实验的假阳性。图像分析统计后发现冠心病血瘀证病人血浆与正常人相比有3个蛋白质下调和6个蛋白质上调。详见表1。2.2胶内酶切提取蛋白的检测选取图像分析统计后病人血浆与正常人相比有改变的蛋白质点,胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定,其中冠心病血瘀证病人血浆与正常人相比升高的蛋白质有免疫球蛋白、纤维蛋白原、粒酶,冠心病心血瘀阻证病人血浆与正常人相比降低的蛋白质有CD44SP。3维护血管内皮细胞血浆蛋白质组学的研究结果表明,冠心病血瘀证病人血浆中纤维蛋白原的水平升高,且与冠心病和卒中的发生率上升有关,纤维蛋白原是心血管病的一个独立的可改变的危险因素。急性或缓慢的纤维蛋白原升高通过几条途径导致心血管病,尤其是动脉粥样硬化灶。纤维蛋白原是由肝脏产生的一种黏附蛋白,可以被血小板α颗粒摄取并储存。纤维蛋白原在冠状动脉粥样硬化形成早期,即与低密度脂蛋白一起侵入动脉壁,它可直接损伤血管内皮细胞并破坏血管内皮细胞的抗凝和纤溶活性。纤维蛋白原通过其在血小板上的配体血小板膜糖蛋白(Gp)Ⅱb/Ⅲa使血小板聚集及血小板与单核细胞的黏附,促进炎症和血栓形成。纤维蛋白原的另一重要功能是通过其r3序列结合到细胞间黏附分子-1(ICAM-1)并调整ICAM-1依赖性黏附,作为内皮细胞和单核细胞间必需的桥连子而在冠状动脉粥样硬化的免疫炎症反应中起重要作用。纤维蛋白原作为冠心病的独立危险因素,在冠状动脉粥样硬化斑块中和动脉粥样硬化病人血中表达增高,并且其表达量随临床严重程度的加重而增加。研究发现,纤维蛋白原除了参与凝血过程外,还刺激血管平滑肌的迁移和增殖,促进血小板聚集性增高,血黏稠度改变。故认为高纤维蛋白原血症在动脉内壁的沉积可能先于低密度脂蛋白的沉积,在冠心病的发展中,特别是早期其作用可