中药活性成分筛选的通量研究技术

中药活性成分筛选的通量研究技术

目前，中国的创新药物研究水平仍然很低。临床药物长期依赖制备和进口，每年进口300亿元。目前国际上对新药研发竞争激烈,但同时新药研发困难重重,研发速度并未加快,技术难度不断提高,2010年仅有20个新化学结构药物获FDA批准上市,新药发现模式亟待改变。如何使我国摆脱药物依赖进口和仿制的困境是我国医药卫生领域的一个战略课题。研究表明具有数千年临床经验的中药是创新药物的宝库,如何从这一宝贵资源出发,在网络药理学和高通量技术支持下推动中药的现代化和国际化是一个亟待解决的重大问题,具有重大社会价值和经济价值。中药现代化和物质基础研究是医药界的研究难题,复方和药材含有众多的活性成分,常规提取分离和活性筛选不仅速度慢、成本高,而且还存在活性成分易丢失,纯度与活性背离的难题。以上问题的解决关键在于三个方面,一是如何快速得到含有活性化合物的民族医药样品,二是如何高效研究其中活性成分,排除与主治无关或毒性成分,三是在网络药理学指导下研究各组分对多靶点的活性。1民族药分离的应用进展高通量技术是解决中药活性成分研究难题的思路之一。所谓高通量技术包括高通量制备、高通量筛选、高通量基因芯片、高通量蛋白芯片等技术。现代制备色谱技术以快速、高效、高载样量和自动化为特点,融合了传统色谱的经典理论和现代科学技术中的众多创新之处,解决了许多传统色谱未能解决的问题。可用于少数民族传统医药样品的快速制备和分离。可用于高通量制备的色谱包括快速制备色谱(闪式柱色谱)、中压制备色谱、高压制备色谱、高速逆流色谱、超临界流体色谱等。值得注意的是,提取过程应在传统医药的配伍理论、炮制工艺和使用方法的指导下进行,尽量保持所制备组分中的物质忠实于民族药物的原始面貌,除最常使用的水、乙醇等溶剂提取法,还可采用水蒸气蒸馏法提取挥发油、采用压榨法提取新鲜药材中含量较高的成分,以及近年发展起来的超临界流体萃取法、超声提取法、微波提取法等都可视具体情况加以应用,使药物中的各种成分得到尽可能全面的提取。研究者常遇到的难题是:在样品分离过程中,有毒溶剂的使用与残留是否将对下一步的筛选工作产生干扰,如何保证民族药物在分离过程中不发生变性,尤其是微量、不稳定、易挥发成分在分离中得以保留,这些关键技术问题需要在预实验中进行耐心考察。闪式柱色谱(flashchromatography,FC)属于中低压液相色谱的一种,于20世纪70年代末开始应用于天然产物的分离纯化。在国外,快速硅胶柱色谱已成功应用于天然产物样品库的建立,并将样品库用于活性物质的高通量筛选。近年来,闪式柱色谱技术引入我国,但在实验室中的应用仅限于植物单体分离和一至几个目标化合物的纯化。由于其快速、便捷、制备量大、经济的特点,应用于快速划段分离,较之常压与高压液相色谱应具有自身的独特优势,因此,本实验室尝试将其应用于少数民族药大复方全组分的快速划段分离,在国内外均具有创新性,分离结果见图1。色谱条件:VenusilMPC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相甲醇-水体系,甲醇中含0.5%乙酸,线性梯度条件0~35min,5%~70%B;35~40min,70%~100%B;流速1mL·min-1;检测波长280nm;柱温30℃;进样量5μL;成分鉴定结果见图2。通过闪式柱色谱技术,可以快速分离到数百个组分,每个组分包含一个单体或为多个单体的组合物,各组分的平均质量为200mg,量少者亦在10mg以上,达到细胞水平筛选和化学分析的用量要求,且该方法重复性高,该技术用于传统复方药物组分制备属于国内外首创,对于中药研究具有重要应用价值。2中药提升抗脑卒中作用的药物靶点AndrewLHopkins在2008年提出“网络药理学是创新药物研发的下一个范式”。网络药理学是系统生物学、系统药理学的发展,与我国中药的有效成分组/群、多层次多机制多靶点概念契合度较高,对中药的发展具有指导意义。以网络药理学为指导,研究疾病发生发展的基因组和蛋白质组,揭示疾病的病理病机,并以此为指导,提高开发创新药物的科学性和准确性。网络药理学认为生命是一个复杂的过程和体系,疾病是由多个彼此之间存在着相互作用和动态变化的基因、蛋白引起的基本生理和病理现象。“组合药靶”是中药药靶的发现策略之一。即根据以往研究进展,从基因功能网络中寻找中药治疗疾病特异相关的基因组合,并观察验证中药对这些特异性基因组合的影响,提供中药的生物活性信息。一旦确证中药影响这些特异性分子组合就可以将这些基因以及由这些基因表达的蛋白作为该中药的“组合药靶”。通过研究验证并完善组合药靶策略有助于民族创新药物的出现和中药的现代化,且由于中药的活性可以为网络药理学提供实证,有助于丰富和发展网络药理学。以脑卒中神经病变为例,国内外针对单靶点开发了大批药物,但临床表现均不佳。目前美国FDA只批准了一个也是唯一的治疗急性缺血性脑卒中的药物———组织纤溶酶原激活剂。根据网络药理学理论,基于多靶点的治疗策略优于传统的单靶点保护思路。神经-血管单元由神经元、血脑屏障、小胶质细胞以及维持脑组织完整性的细胞外基质构成,各组分间相互联系并相互影响,是一个三维微环境,可能成为治疗脑梗后神经病变的网络药理学靶点。神经血管单元(neurovascularunit,NVU)概念突破了以往单靶点药物治疗脑梗死神经病变的不足,为整体研究脑梗死及保护机制、寻找创新药物提供了新思路。神经血管单元中神经元的坏死与胶质细胞、内皮细胞、足细胞及细胞基质有关,也与缺血、再灌、炎症反应、细胞因子途径有关,脑中风导致神经细胞死亡的信号通路的关系,可见多机制、多靶点治疗策略的合理性,与网络药理学的理论相似,见图3。通过以上分析,本实验室认为在抗脑卒中神经病变药物研究中可以针对以下靶点或潜在靶点:细胞内Ca2+,线粒体膜细胞色素C,F0F1复合体,线粒体膜辅酶Q等电子传递链节点,线粒体基因组,胞浆MMPs,PKC,细胞因子,自由基,谷氨酸受体等。根据以上研究进展,理性选择网络药理学靶点是中药现代化的有效思路之一,本实验室针对多个靶点建立了大复方白脉散全组分的筛选模型,通过高通量筛选,取得了很好的进展。3生物活性筛选技术的应用高通量筛选技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据,以计算机对实验数据进行分析处理,同一时间对数以千万样品检测,并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。民族药物的网络药理学研究不能简单采取高通量药物筛选模式,但可以借鉴高通量的思路,建立准高通量的研究方法。即首先根据网络药理学理论合理选择多个靶点,然后构建细胞、分子水平的模型,最后快速评价各组分的活性,旨在提供网络药理学所需信息。本实验针对自由基清除建立高通量筛选模型,对复方白脉散全组分进行筛选和活性评价,得到很好的结果,见图4。以上思路中,细胞水平的活性筛选对于网络药理学的研究极其重要,所采用的技术包括:细胞水平重组技术、荧光检测分析技术、极化荧光技术、时间分辨荧光能量传递分析法、荧光共振能量转移、高内涵筛选、活细胞荧光检测钙流的技术等。细胞水平筛选方法具有可视化、动态、自动化、定量、多参数检测等突出特点,是目前网络药理学不可或缺的手段,对于靶点的确认、化合物初筛和复筛、先导的发现和优化、靶标化合物毒性评价等非常有效。其中高内涵筛选方法的出现,对网络药理学的发展和应用发挥了关键作用。特别是多细胞靶点和多细胞类型的HCS是网络药理学研究的关键技术之一,可能将大大促进新药的发现。4生物芯片技术中药网络药理学研究中,多靶点多机制是研究难点,有必要借助生物芯片进行高通量研究。生物芯片是一类快速、高效、高通量的生物分析器件或集成化分析系统,包括微阵列芯片、微流控芯片、芯片实验室以及相关的仪器和设备。它将计算机、微电子、微机械、生物化学、分子生物学和生物信息学等技术融合到一起,在一个微小的芯片表面或芯片内部的微流体系统研究生物大分子之间或者生物大分子与其他化学小分子之间的反应。生物芯片能整合样品制备、分子识别和反应、信号检测和信号放大等独立的分析过程,使之连续化、平行化、集成化和微型化。根据芯片上固定的物质不同,生物芯片可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片以及组织芯片。基因芯片(genechip)又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray),是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。蛋白质芯片(proteinchip或proteinmicroarray)是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质按微阵列方式固定在微型载体上获得。细胞芯片(cellchip)是将细胞按照特定的方式固定在载体上,用来检测细胞间相互影响或相互作用。组织芯片(tissuechip)是将组织切片等按照特定的方式固定在载体上,用来进行免疫组织化学等组织内成分差异研究。根据网络药理学理论,所有药物(或兽药)都是直接或间接地通过修饰、改变人类(或相关动物)基因的表达及表达产物的功能而生效,而生物芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况的能力,在中药研究方面具有巨大的优势。有助于更加全面、更加快速分析中药中的活性成分和毒性成分,进而提高中药开发的效率。5基于基因表达谱的分析生物芯片可用于预测不良反应如毒性。由于中药作用机制的复杂性,传统的毒理研究方法需要大量动物实验,确定药物的潜在毒性时间长,并且难以对中药从整体到细胞水平、甚至蛋白质与基因水平进行较全面的评价。而慢性毒性和副作用往往涉及基因或基因表达的改变。利用基因表达谱对比研究某种中药或其提取物作用于动物前后,特定细胞中相关物质功能基因表达mRNA的异常变化,可提示该中药在研究剂量下是否具有毒性及产生毒性的作用机制。生物芯片用于研究中药的毒副作用可以减少动物实验,提高用药的安全性。使得药物筛选的靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,甚至可能在几