抗肿瘤药物的筛选与筛选

抗肿瘤药物的筛选与筛选

肿瘤是一种常见的疾病，严重威胁着人类的生活质量。他被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究,抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的一个环节,而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强﹑对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物,是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视,投入了大量的人力﹑物力﹑财力,每年都有大量的化合物(合成药﹑天然产物和微生物发酵产物)待筛,抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。80年代中期以前,普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病/淋巴瘤模型P388和L1210为基础的,所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛,能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉,无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷,1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法,即放弃体内小鼠筛选,代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系,其主要优势有两点:其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质;其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实,过去动物筛选需较大量的天然产物,而现在天然产物的需要量就大大减少,可以指导有效成份的进一步分离纯化,使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。下面对现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法做进一步的阐述。1端粒酶活性的检测端粒是染色体特殊结构,起着保护染色体的完整和稳定性的作用,端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶,由RNA和蛋白质组成,可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性,而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此,认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系,有可能成为肿瘤治疗的靶点。为了准确测定端粒酶的活性,现普遍采用端粒重复扩增法(telomericrepeatamplify-caionprotocol,简称TRAP)参照Kim等人方法,但有部分改进。具体方法如下所述。1.1pcr扩增pcr取细胞酶提取液1μL分别加入TS引物0.36μmol/L,dNTP50μmol,TaqDNA多聚酶1IU,CX引物0.28μmol/L,Mg2+1.5mmol,在25μL反应液中进行PCR扩增。扩增程序为在30℃反应30min,72℃30s,然后在94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,进行30个循环。1.2聚丙烯酸凝胶电泳分析和开发区用12%丙烯酰胺灌胶,胶聚合后,取扩增产物1025微升加入加样孔,以180V的电压进行电泳2h左右。1.3显色凝胶的制备用10%乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35min,然后加入硝酸银溶液(最终浓度为0.2%),在37℃水浴上振荡染5min,用超纯水洗涤三次。再加入显色液(30%的NaOH和0.1%的甲醛)振荡直至DNA条带出现,一般为20min。最后将显色凝胶移至固定液中固定5min。普通光源照像。1.4端粒酶活性的判断由于端粒是由短DNA重复序列组成,而端粒酶的作用是维持端粒末端的长度,因此可以用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性。即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带,则判断端粒酶的活性依然存在为阳性。恶性肿瘤治疗的理想靶点应该是寻找到一种对肿瘤细胞生长所必须,但又不存在于正常细胞的物质。端粒酶就是一种在许多肿瘤组织中处于高表达活性,而在正常组织中却没有酶活性表达的特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。它在维持肿瘤细胞的高度增殖时,对端粒的缩短起着重要的作用,从而提示端粒酶可能是恶性肿瘤组织的一个标志。2活细胞的检测快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法,其原理为采用一些特殊的荧光染料,对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料,通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染料FDA(Fluoresceindiacetate),在正常情况下它不具有荧光,但当它加入到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时,由于细胞分泌的水解酶的作用,FDA水解释放出具有强烈荧光的荧光素。死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏,FDA水解水平大大降低,这样通过测定培养液中荧光的强度,就能测定活细胞的数量,从而测定出药物对细胞的作用,推测其抗肿瘤的效果。2.1细胞不加药物该实验采用体外培养的不同种肿瘤细胞系,经0.25%胰酶加0.02%EDTA消化后吹打,600-800rpm离心,稀释至细胞浓度为5×104个/mL。每组3-4个平行孔,接种在微孔培养板中,对照组只加细胞不加药物。37℃5%CO2条件下培养。2.2终浓度0.0.0.5.4%常规传代细胞待贴壁后,每孔加药,使药液终浓度为0.1ug/mL,0.5ug/mL,1ug/mL,5ug/mL,10ug/mL,放入培养箱中培养至最佳作用时间。2.3荧光强度测定培养至最佳作用时间的细胞移去培养液,用PBS缓冲液冲洗两遍,准确加入1.8mL/孔PBS缓冲液,随后加入200uL/孔含FDA的DMSO储备液(100ug/mL),使其终浓度为10ug/mL,摇匀后,37℃5%CO2条件下培养1h,用荧光分光光度仪RF-540在激发光波长为485nm,发散光波长为538nm,狭缝为2nm,衰减为5(×16)的条件下测定每孔溶液的荧光强度值。荧光素测定法具有快速﹑灵敏﹑准确性高﹑重现性好的特点,其细胞测定范围宽﹑线性好,适用于大量抗肿瘤药物的筛选和临床抗肿瘤药物的预试。3结晶紫染色法结晶紫染色测定法是由Gillies等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收,死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取,通过测定提取液的光密度值(OD),就可测定活细胞的数量。近几年经过不断改进,结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定,具有灵敏度高﹑重现性好的特点。实验方法如下。3.1细胞不加量检测实验采用体外培养细胞系,经0.25%胰酶加0.02%EDTA消化后吹打,600-800rpm离心,稀释至细胞浓度为5×104个/mL。每组4个平行孔,接种在微孔培养板上。空白孔只加营养液不加细胞,对照孔只加细胞不加药物。37℃5%CO2条件下培养。3.2浓度为0.0.0.5%的情况常规传代细胞待贴壁后,每孔加药液,使药液终浓度为0.1μg/mL,0.5μg/mL,1μg/mL,5μg/mL,10μg/mL等。放入培养箱培养至最佳作用时间。3.3结晶紫的提取至最佳作用时间的细胞用11%的戊二醛固定,摇20min,使细胞停止生长,达到实验结果的均一性。固定后的细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。37℃烘干。加入0.1%的结晶紫液对细胞染色。振摇30min,用蒸馏水洗涤,至剩余的结晶紫液冲洗干净。37℃烘干。加入10%的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取,1h后在波长为595nm处测定。结晶紫染色测定法具有快速﹑灵敏﹑准确性高﹑重现性好的特点,是一种较好的抗肿瘤药物的筛选方法。4诱导噬菌体—应用噬菌体筛选抗肿瘤药物已确证多种病毒能引起动物肿瘤,噬菌体是细菌的病毒,与肿瘤病毒相似,噬菌体的DNA也可整合到细菌染色体上,随细菌DNA复制分裂并传至子代细菌,不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变。有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱落,复制合成并释放出完整的噬菌体,致使敏感的细菌感染裂解,这种作用称为诱导作用。有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用,因此在研究肿瘤病毒—肿瘤细胞间关系时,常与溶原性噬菌体—溶原性细菌模型相比拟,同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物,并且已经取得一定成效。实验方法(双层琼脂平板—纸片法)如下:(1)用pH7.4之2%固体琼脂倾注于平皿底部,厚为2mm,凝固后待用。(2)取100mlpH7.4之0.7%半固体营养琼脂,溶化后冷却至50℃,加入培养18h并已稀释10-4之金色葡萄球菌75培养液4mL及培养18h未稀释之金色葡萄球菌47培养液4mL,混匀后,倾入平板上层,厚约1mm。(3)上层琼脂凝固后,用6mm直径之无菌圆形滤纸片1片,沾取待筛药物浸膏贴于平板上,另以争光霉素为阳性对照,于37℃中培养。(4)24h后观察结果,阳性结果:溶原性细菌释放多量成熟的嗜菌体,侵入指示菌体内繁殖,而使指示菌裂解,在滤纸片周围出现密集之噬斑。阴性结果:滤纸片周围与背景相同。通过实验证明,具有诱导噬菌体作用的药物大多具有抗肿瘤作用,且用噬菌体—细菌间特性建立的筛选模型具有简便﹑迅速﹑适宜大量药品筛选的特点,可以广泛应用于抗肿瘤药物的筛选。5阻断致瘤病毒复制肿瘤的发生是一种多步骤﹑多因素作用的疾病,其中病毒是肿瘤发生重要的环境因素之一。目前已明确许多病毒与人类恶性肿瘤的发生有关,这些病毒基因在细胞内复制﹑表达﹑通过多种不同的途径,导致细胞向恶性转化,引起肿瘤的发生。随着病毒致瘤的机制逐渐被阐明,阻断致瘤病毒复制将成为抗肿瘤药物筛选的基本策略之一。可以通过对以下机理的了解,来筛选抗肿瘤药物。5.1阻止病毒与靶细胞的结合和融合病毒感染的最初步骤就是病毒颗粒吸附于靶细胞,并通过与靶细胞受体结合而与靶细胞融合形成合胞体,抗体和疫苗可以阻断病毒与靶细胞的结合。5.2类药物抑制病毒复制病毒进入细胞后,DNA的复制需要核苷类化合物,应用核苷类药物不仅可以抑制病毒复制的酶,而且可以竞争性地进入细胞后磷酸化,渗合到病毒复制的DNA中,阻断DNA链的延长,抑制病毒复制。这方面的药物包括核苷类和开环核苷类。5.3抑制病毒复制的酶(1)抑制imp脱氢酶次黄嘌呤核苷酸脱氢酶是嘌呤单核苷酸生物合成的关键酶,负责将IMP转换成黄嘌呤核苷酸,并进一步形成GMP,GDP和GTP以及从GDP经dGDP到dGTP,抑制IMP脱氢酶可以影响RNA和DNA的合成。虽然IMP脱氢酶被认为是细胞的靶标,但是这样的合成在病毒感染的细胞中,需求量将增大。因此IMP脱氢酶的抑制被认为主要是影响病毒RNA和/或DNA的合成。(2)抑制反向转移酶逆转录酶是一种依赖RNA的DNA聚合酶,一些致瘤性病毒就是通过逆转录酶以RNA作为模板合成DNA,设法阻断这一过程可阻断病毒复制。(3)蛋白水解颗粒的制备蛋白酶是一种催化肽链水解的酶,由于病毒表达的结构蛋白和酶是一类大的多聚蛋白体可装配成传染性的子代病毒,必须依赖蛋白酶对多聚蛋白体进行水解,如果病毒蛋白酶被抑制则不能装配成具传染性的颗粒。以上所述都是一些阻止病毒复制的方法,而病毒与恶性肿瘤的生成有着密切的关系,有效的阻止病毒的复制往往就能使恶性肿瘤的发生率大大降低,因此正确判断一种药物是否具有阻止病毒复制的功能是进行抗肿瘤药物筛选的一个重要方面。6关于实现中药作用的方法我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论,天然中药以其疗效广泛﹑确切﹑毒性低受到国内外的广泛关注。近年来,从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视,因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。经过长时间的摸索,除以上所述的几种方法外,对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法,现在一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系,以培养细胞为实验模型,用MTT实验﹑软琼脂等方法,在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用,筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。在此基础上,以荷瘤小鼠为实验模型,在动物水平检测其在体抑瘤作用。具体方法如下:6.1细胞水平的选择(1)dmso处理细胞培养肿瘤细胞用含10%热灭活的小牛血清的RPMI1640培养液于37℃,5%CO2及饱和湿度下培养。药物处理将中药单体或提取物分别溶于DMSO,作用于培养细胞体系。药物浓度在0.005至0.5(mg/mL)之间,等量DMSO作为阴性对照。培养体系中溶剂浓度不超过1%。培养24h后,显微镜下观察细胞状态。体外药物敏感性分析针对药物单体,以几种肿瘤细胞系为实验模型,以MTT实验法分析其体外抗肿瘤活性。(2)细胞培养和集落形成首先制备底层琼脂,将其加入12孔板中,每孔2mL室温放置1h以上,待其充分凝固。取对数生长期的肿瘤细胞用含0.01%EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化,用培养基稀释成单细胞悬液,并调整浓度至1×104个细胞/mL。然后取42℃预温的琼脂粉/培养基混合物1.2mL与0.8mL含有不同药物的细胞悬液迅速混匀,取1mL铺于底层琼脂之上,每个样品设3个复孔。置室温待其充分凝固后,于细胞培养箱中培养两周。在显微镜下观察集落形成情况并计数。集落计数方法:在镜下随机记数,每一孔中5个视野内的集落数(集落确定标准:4个细胞以上),计算各自总和,取3复孔的平均数做比较。(3)细胞毒性试验合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC50<10ug/mL,或植物粗提物的IC50<20ug/mL,并且有细胞毒性的剂量依赖关系,且最高抑制效率达80%以上,则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。6.2动物水平的选择(1)注射方式及药物分三组,每组三只。药物溶于橄榄油,以腹腔注射方式给药,阴性对照组只注射橄榄油,试验组同时注射待筛选药物,200mg/kg体重,2天1次。观察给药后行为,为期4周。(2)细胞成瘤的测定将小鼠背部皮下接种2×106H22小鼠肝实质瘤细胞,5-7天后可见成瘤。将40只荷瘤小鼠随机分为四组,药物溶于橄榄油,腹腔注射给药,试验为期10周。处死小鼠后,收取肿瘤标本,称量肿瘤重量。(3)疗效评价标准实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示,即瘤重抑制率=(1-试验组瘤重/对照组瘤重)×100%,中药抑制率大于30%,合成药大于40%,且有统计学意义,重复3次,疗效稳定,则评价有一定抗肿瘤作用。7新靶点、新化合物的发现和应用如今,抗肿瘤药物的筛选已经由针对化合物的筛选体系转变为针对疾病的筛选体系,但目前所应用的筛选系统只适合于随机筛选,比较理想的筛选体系应该是以机理为基础的或针对机理的筛选系统。近年来分子肿瘤学的研究所取得的进