利用褐藻胶降解寡糖制备抑菌菌

利用褐藻胶降解寡糖制备抑菌菌

目前，抗菌素的广泛应用对环境造成了严重的污染。由于突变，细菌的耐药性产生了抗药性，耐药性水平逐渐提高。大多数细菌都获得了抗药性基因。解决这一日趋严重问题的主要对策,就是开发研制对耐药菌株有效的新药和新制剂以逐步代替抗菌素的大量使用。褐藻胶寡糖是由褐藻胶经过一定方法降解而成了的聚合度在3~10之间的寡糖分子,其具有溶解性强、稳定性好、易被机体吸收等优点。近年来,褐藻胶寡糖的生理活性不断被揭示,尤其在促生长作用、增强机体免疫功能、抗肿瘤和对神经元损伤的保护作用等方面的研究很多,但是有关褐藻胶寡糖对真菌和细菌进行抑菌活性的研究报道较少。因此,优选褐藻胶寡糖的最佳降解条件,同时对褐藻胶寡糖对真菌和细菌进行抑菌活性的研究,将能为褐藻胶寡糖在抗菌药物上的应用研究奠定基础,并提供一定的实验及理论参考依据。1材料和方法1.1试剂及培养基供试菌种金黄色葡萄球菌1.72、大肠杆菌1.543购于中国普通菌种保藏中心,藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、青霉曲霉、啤酒酵母由上海水产大学食品学院微生物研究室提供。供试试剂有海藻酸钠(化学纯,国药集团产品)、30%过氧化氢(分析纯)、NaCl(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、普通营养琼脂,PDA培养基等。试验使用的仪器有85-2型磁力搅拌器、乌氏粘度计(毛细管内径0.5~0.6mm)、电子秒表、恒温水浴(自制,带有搅拌装置,恒温±0.05℃)、HHS-2型恒温水浴锅、S-3C型pH计、SHZ-3循环水真空泵、布氏漏斗、CS101-24电热鼓风干燥箱、无菌操作台、灭菌锅、恒温培养箱、游标卡尺、牛津杯(内径6mm)、微孔滤膜(孔径0.22μm)、过滤器等。1.2测试方法1.2.1降解反应条件的确定取一定量的褐藻胶干粉,加适量蒸馏水于磁力搅拌器缓慢搅拌下均匀溶解,使褐藻胶溶液终浓度为每100mL溶液中含褐藻胶1.25g。设反应温度分别为40℃、60℃、80℃,过氧化氢体积百分比浓度分别为3%、5%。反应中不断缓慢搅拌,在反应过程的0、0.5、1.0、1、5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h分别取出部分反应液,冷却至室温后加入无水乙醇进行醇析,真空抽滤后将所得沉淀铺于培养皿中,置于50~60℃鼓风干燥箱内烘干。当褐藻胶分子量降到足够低,乙醇难以醇析出时,将反应液置于50℃~60℃鼓风干燥箱内烘干,研磨成粉末备用。每种降解反应条件2个重复,取平均值。采用粘度法测定不同降解条件下寡糖的特性粘度,根据Donnan经验公式即聚合物的平均聚合度(DP)和特性粘度(η)的关系为:DP=58×(η),计算出平均聚合度,绘出降解曲线图,以平均聚合度低于10的寡糖为目标产物,优选出最佳降解条件。1.2.2抑菌圈测定(1)培养基配置:培养基按常规方法配置,其中普通营养琼脂培养基用于细菌的培养,PDA培养基用于真菌的培养。(2)菌种活化及培养:细菌接种于普通营养琼脂培养基上,37℃培养24h。真菌接种于PDA培养基上,28℃培养72h。每种菌传代2次后进行活化。(3)样品溶液制备:取褐藻胶干粉及最佳降解条件下获得的寡糖干粉适量,无菌蒸馏水充分溶解,用无菌微孔滤膜过滤不溶物后备用(褐藻胶不需过滤)。(4)菌悬液的制备:挑取1环已活化好的菌种,放入9mL无菌生理盐水中,震荡均匀,制得系列菌悬液。菌浓度107~108cfu/mL,备用。(5)样品液抑菌效果测定:采用管碟法,通过观察抑菌圈大小来考察寡糖抑菌效果。预实验确定糖液浓度,确保抑菌圈大小适中。在超净工作台中,以无菌吸管移取1mL菌悬液于无菌培养皿中,再移入20mL温度为45℃的培养基,充分混匀,冷却凝固后,用记号笔在皿底以圆心为中心划“十”字,分别在1/4区域依次标注生理盐水、寡糖、苯甲酸钠、寡糖等记号。然后,在各1/4区域的正中央烙上无菌牛津杯,按皿底标注分别注入相同浓度的寡糖溶液、苯甲酸钠溶液和无菌生理盐水,直至加满为止。每组重复3次。将培养皿正置于恒温培养箱内培养48h,观察抑菌圈大小,并用游标卡尺测量抑菌圈直径(精确到0.02mm)。(6)最低抑菌浓度(MIC)测定:对能产生明显抑菌圈的菌种进一步进行最低抑菌浓度的测定。利用2倍逐级稀释法,将样品溶液稀释为10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%。分别向平皿中移入上述浓度的样品溶液1mL,并移入浓度为108cfu/mL的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母5种菌悬液各0.2mL,加20mL温度为45℃的培养基,混合均匀,冷却凝固后倒置于恒温培养箱内培养48h,观察生长情况。2结果与分析2.1褐藻胶的降解曲线经粘度法测定褐藻胶的平均聚合度为474。在不同温度(40℃、60℃、80℃)、不同过氧化氢体积百分比浓度(3%、5%)下,经不同时间的降解,得到降解程度不同的寡糖混合物。采用粘度法测这些寡糖的特性粘度(η),由Donnan经验公式进一步算出寡糖的平均聚合度DP。根据各样品的平均聚合度绘制出褐藻胶在不同降解条件下的降解曲线,结果见图1和图2。从图1和图2可以看出,在降解反应开始的0.5h内,由于过氧化氢浓度大,在本试验设定的条件下反应速度很快,聚合度下降迅速;随着降解反应时间推进和过氧化氢消耗,1h后降解速度趋于平缓,2h后聚合度基本保持不变,当过氧化氢耗尽时,反应基本完成。从图1和图2还可以看出,在高温条件下,由于过氧化氢分解快,降解作用维持的时间短。在温度为40℃和60℃、过氧化氢浓度为3%和5%条件下,褐藻胶经过3.5h的降解仍得不到平均聚合度10以内的寡糖,在温度80℃、过氧化氢浓度为3%和5%条件下,褐藻胶经过1.5h的降解后均可获得平均聚合度10以下的寡糖。为了节约时间,降低成本,尽量减少过氧化氢的残留,本研究选择温度80℃、过氧化氢浓度3%条件下降解1.5~2h为获得平均聚合度10以下寡糖的最佳降解条件。2.2褐藻胶寡糖抑菌圈的测定经48h培养后,样品液对不同菌的抑制效果见图3。用游标卡尺测量抑菌圈大小,结果褐藻胶寡糖对细菌的抑菌圈大小见表1,褐藻胶寡糖对真菌的抑菌圈大小见表2。从图3、表1和表2可以看出:(1)褐藻胶寡糖对细菌均产生明显的抑菌圈,真菌中仅对啤酒酵母产生较小的抑菌圈,且对照组的生理盐水和相同浓度的苯甲酸钠均不产生抑菌圈。说明在相同浓度情况下,褐藻胶寡糖对以上7种菌的抑菌效果强于苯甲酸钠。(2)比较抑菌圈直径大小发现,在2.5%寡糖浓度下,藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大,枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈次之,而在5%的较大寡糖浓度下,啤酒酵母产生的抑菌圈却更小,青霉和黑曲霉均不产生抑菌圈。说明褐藻胶寡糖对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制作用最强,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的生长抑制作用次之,对真菌的抑制作用不理想。2.3褐藻胶寡糖对酵母菌生长的影响最低抑菌浓度(MIC)是指抑制细菌生长所需的最低浓度。经48h的培养后,观察在不同浓度褐藻胶寡糖下细菌和真菌的生长情况,结果见表3。从表3可以看出,较低浓度的褐藻胶寡糖即可抑制细菌生长。据测定,褐藻胶寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的最低抑菌浓度仅需0.625%,对枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度需2.5%,对啤酒酵母的最低抑菌浓度则高达10%。最低抑菌浓度与抑菌圈结果基本一致。对照组中的褐藻胶由于溶解度小,粘度太大,不能有效扩散进入培养基中,可能影响其抑菌效果,限制了其在抑菌方面的应用。3褐藻胶寡糖降解过氧化氢的最佳条件确定过氧化氢在酸性环境中氧化能力较强且反应速度较慢,本研究利用褐藻胶自身的微酸环境来进行过氧化氢的氧化降解。过氧化氢具有强大的漂白作用,可以使各种色素消失,制得外观洁白的产品;此外,过氧化氢极易分解、挥发,尤其在高温下分解更快,可以有效避免过氧化氢在产品中的残留,在反应过程中不生成诸如盐分等其他杂质,简化了后续步骤,降解速度快,效率较高,三废污染低,比酸降解更为优越。本研究结果表明,过氧化氢体积百分比浓度3%、温度80