固定化微生物载体材料的制备及其在麦汁发酵中的应用

固定化微生物载体材料的制备及其在麦汁发酵中的应用

固定化技术是在20世纪中期发展起来的一种新生物技术。它的发展可以分为两个阶段。第一个是固定化酶阶段，始于20世纪50年代，第二个是固定化细胞阶段，诞生于20世纪70年代中期，但后者的应用范围和发展前景远远超过了第一个。1983年，在美国著名的杂志encyme和美国国立科学院首次提出了“固定化酶”的概念。“固定化生物催化剂”一词于1983年首次出现在美国著名杂志enhyme和微型生物技术研究所。所谓固定化生物催化剂是一种使用化学或物理方法将游离生物催化剂固定在有限的空间区域内，以保持活性并重复使用的新型生物技术。因此，它具有小型高效、稳定、重复和连续使用、易连续反应和自动控制等优点，提高了产品的纯度和过程效率，克服了环境敏感、性质不稳定、易迷失或死亡等缺点。同时，固定化生物技术可以充分利用化工过程中的非均匀相氧化技术优势。海藻酸钠和壳聚糖均是无毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料,且具有一定的保健功能.海藻酸钠-壳聚糖已被应用于药物控制释放、固定化生物催化剂、细胞培养及微反应器、人体器官和基因运载工具以及分离介质等领域,效果良好,应用前景十分广阔.作者以壳聚糖-海藻酸钠复合水凝胶固定化啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),并对海藻酸钠质量分数、壳聚糖质量分数、固化时间、覆膜时间等因素对复合水凝胶的硬度和固定化啤酒酵母发酵降糖的影响进行研究,以期为壳聚糖-海藻酸钠复合水凝胶在啤酒酿造方面的应用奠定基础.1材料和方法1.1试剂及仪器海藻酸钠(SA)成都市联合化工试剂研究所生产;壳聚糖(生化试剂,DD≥90%),上海伯奥生物科技有限公司生产;冰醋酸(AR),天津市博迪化工有限公司生产;氯化钙(AR),天津市科密欧化学试剂有限公司生产;氯化钠(AR),汕头市光华化学厂生产;啤酒酵母,广州微生物研究所生产;麦芽汁,珠江啤酒厂生产,琼脂(生化试剂),汕头市水产品综合加工厂生产.QTS-25TextureAnalyser,CNSFARNELL生产;2WAJ阿贝折光仪,上光实业有限公司生产.1.2测试方法1.2.1壳聚糖的制备将酵母菌悬液与除菌海藻酸钠溶液混合均匀,缓慢滴入体积分数4%的氯化钙溶液中即成白色球形颗粒,并缓慢搅拌使其悬浮在氯化钙溶液中,此时钠离子与钙离子相互置换,海藻酸钙胶珠逐渐硬化定型(球形颗粒),继续在氯化钙溶液中固化2h,然后在体积分数为0.5%的壳聚糖溶液中覆膜30min,经生理盐水洗涤3次后,置冰箱备用.1.2.2外观发酵度测定发酵度是指麦汁中浸出物被酵母消耗部分与原麦汁浸出物总量之比.发酵度分为外观发酵度、真正发酵度和最终发酵度.外观发酵度是发酵过程中外观糖度降低的百分数,是以糖度表实测外观残留糖度而计算的发酵度.由于测量时未考虑酒精、CO2的影响,所以比实际糖度要低.其测得发酵度比实际发酵度要高.本试验用2WAJ阿贝折光仪测定发酵前后麦芽汁的糖度,并按下式计算其外观发酵度:外观发醉度(％)=原麦汁糖度−发酵后麦汁糖度原麦汁糖度×100%(％)=原麦汁糖度-发酵后麦汁糖度原麦汁糖度×100%外观发酵度越高,表明发酵过程中外观糖度降低越大,啤酒酵母的发酵能力越强,因而它是发酵管理的一项重要内容,也是酵母降糖及啤酒质量控制必要措施之一.1.2.3凝胶硬度测定将QTS-25TextureAnalyser上直径为10mm的圆柱形探头置于凝胶表面,以15mm/min的速度下降,当圆柱形探头下降6mm时测得凝胶硬度,单位为克.2结果与讨论2.1固定化载的硬度研究2.1.1海藻酸钠质量分数对载体硬度的影响分别用质量分数为1.0%、1.5%、2%、2.5%和3%的海藻酸钠制备5个样品,研究海藻酸钠质量分数对固定化载体硬度的影响,结果见图1.由图1可以看出,随着海藻酸钠质量分数的增加,载体的硬度呈现逐渐增大的趋势.其可能是由于随着海藻酸钠质量分数的增加,单位体积内海藻酸钠分子数增多,其长链分子堆砌在一起更容易发生链的缠结,勾结点可看成是可移动的交联点,海藻酸钠分子内、分子间也更易形成氢键,而氢键的缔合则类似于交联网络结构中的交联点,交联点增多则结构致密,从而导致海藻酸钠质量分数增大时其硬度也随之增大.海藻酸钠的质量分数一般不小于1.0%,否则会因聚阴离子溶液的粘度太低而在下滴过程中严重变形,凝胶在氯化钙溶液中难于形成球形颗粒.2.1.2固化时间的影响分别在固化时间为0.5h、1h、1.5h、2h和3h时制备5个样品,研究固化时间对载体硬度的影响,结果(图2)表明,随着固化时间的增加,载体的硬度也随之增大.这是由于固化时间越长,海藻酸钠与氯化钙的反应就越完全,形成的海藻酸钙胶珠就越致密.因此用壳聚糖溶液覆膜后的海藻酸钙-壳聚糖固定化载体具有更好机械强度.2.1.3壳聚糖质量分数对载体硬度的影响分别用质量分数为0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%的壳聚糖制备5个样品,观察壳聚糖质量分数对载体硬度的影响,结果见图3.由图3可以看出,载体的硬度随着壳聚糖质量分数的增加而不断增大.当壳聚糖质量分数由0.3%增加到0.5%时,载体硬度增加的速率较快,而质量分数在0.5%～1.0%时,载体硬度增加的速率较为缓慢.这是由于随壳聚糖质量分数的增加,载体外膜厚度就越大,而壳聚糖本身具有一定的硬度,从而使得载体硬度随着壳聚糖质量分数增加而增大;但当质量分数达到一定值时,载体外膜厚度增加速率变慢,因而其硬度增加也随之趋缓.2.1.4覆膜时间对载体硬度的影响分别用覆膜时间为5min、10min、15min、20min和30min制备5个样品,研究覆膜时间对载体硬度的影响,结果如图4所示.从图4可以看出,载体硬度随着覆膜时间的增加而不断增大.这是由于覆膜时间越长,海藻酸钙与壳聚糖之间的正负电荷的吸附就越完全,同时壳聚糖覆在载体表面的厚度就越大,从而载体硬度也就越大.2.2固定化器的应用研究2.2.1海藻酸钠质量分数对外观发酵度的影响按照固定化载体制备方法,在其他条件不变的情况下,包埋一定质量浓度的酵母菌液,改变海藻酸钠质量分数,观察海藻酸钠质量分数对外观发酵度的影响,结果如图5所示.从图5可知,当海藻酸钠质量分数为1%时,载体降糖能力最强,外观发酵度达最大.原因可能是当海藻酸钠质量分数较低时,形成的载体较海藻酸钠高时透明,且较疏松,固定微生物的能力也较弱,部分酵母从固定化载体中泄露出来成为游离的啤酒酵母,游离的啤酒酵母因直接和麦汁中的可发酵性糖接触,所以麦汁糖度下降最快,其外观发酵度也最大.2.2.2固化时间对载体外观发酵度的影响按照固定化微囊制备方法,在其他条件不变的情况下,包埋一定质量浓度的酵母菌液,改变固化时间,观察固化时间对外观发酵度的影响,结果如图6所示.从图6中可以看出,固化时间为3h时,载体外观发酵度最大.这是由于海藻酸钠与钙盐作用后,分子中钠离子与钙离子进行交换,生成海藻酸钙.由于Ca2+的交联作用,随着固化时间的增加分子间相互作用力增强,使线性分子彼此相互连接形成空间网状结构,酵母在其中活动空间增加,繁殖加快,降糖速率也随之加快.2.2.3壳聚糖含量对降糖效果的影响按照固定化微囊制备方法,在其他条件不变的情况下,包埋一定质量浓度的酵母菌液,改变壳聚糖质量分数,研究壳聚糖质量分数对外观发酵度的影响,结果(图7)表明,壳聚糖溶液质量分数虽然相差不大,但覆膜后降糖能力却有明显区别.当壳聚糖质量分数为0.8%时,外观发酵度最大.本试验采用的壳聚糖脱乙酰度大于90%,即壳聚糖分子链上氨基的数量占90%以上,而乙酰氨基数量在10%以下.由于壳聚糖分子中存在大量的氨基,氨基易发生电离而带正电荷,可与海藻酸钙分子中大量带负电荷的羧基通过正负电荷吸引形成聚电解质膜.当壳聚糖质量分数为0.8%时,形成的壳聚糖—海藻酸钙聚电解质膜能使海藻酸钙—壳聚糖固定化载体具有较合适的强度和较好的渗透扩散性能,因而其外观发酵度最大.2.2.4覆膜时间和覆膜厚度对啤酒外观发酵度的影响包埋一定质量浓度的酵母菌液,改变覆膜时间,观察覆膜时间对外观发酵度的影响,结果(图8)表明,不同覆膜时间处理间其外观发酵度相差并不是很大.当覆膜时间为10min时,其外观发酵度最大.这是因为随覆膜时间的延长,载体外的壳聚糖膜越厚,渗透扩散性能下降,载体中游离的啤酒酵母与可发酵性糖接触较少.因而外观发酵度不高.所以膜并不是越厚越有利于发酵,适当的膜厚度才有利于营养物质的进入以及代谢物质的排出.3聚糖质量分数对载体硬度的影响海藻酸钠与壳聚糖可形成复合水凝胶,它可作为一种载体材料用于固定啤酒酵母,并