芬兰畜禽肠道微生物的特性

芬兰畜禽肠道微生物的特性

1动物肠道微生物菌群的概念动物胃中的微生物是一个独特且多变的生态系统。这也是发现的生态系统中细胞密度最高的系统之一（后门，2005）。尽管该系统中积聚着大量的微生物，同时细菌与宿主细胞之间紧密地接触在一起，但据认为这对正常的肠道微生物菌群非常有利。肠道微生物积极地同连接免疫细胞的黏膜相互作用(Umesakit和Setoyama,2000)。非病原性的肠道正常微生物也能保护肠道免受有害微生物的侵染，宿主和微生物菌群的共生可促进动物机体的健康，提高动物的生产力(Hopper,2000)。畜禽生产过程中所应用的抗生素生长促进剂(AGPs)不仅能有效地抑制特定的胃肠道感染，而且能够打乱宿主与肠道微生物之间的正常平衡(Dibner,2005)。长期以来人们忽视了动物健康的维持，而宿主和微生物之间的平衡则是动物健康的第一步。但是，最近AGPs的禁用激发了人们保护和控制肠道正常微生物的欲望。在最新的微生物菌群强化方法中，第一步是描绘正常微生物菌群的特性。对存在着许多未知种类的微生物以及无数可变因素的肠道微生物菌群进行研究是比较困难的，而且由于传统分析方法(如细菌培养)的不完备，造成了人们对肠道正常微生物菌群组成的了解在很大程度上仍然是个未知数。近20年来，建立在探测细菌核酸基础上的研究方法使人们能够对微生物区进行更详细的分析，但是人们越来越希望能用更全面和更简明的方法描述肠道微生物菌群(Zoetendal,2004)。在芬兰的研究项目中，一种专用于细菌菌群的快速流式细胞术(flowcytometry,FCM)方法被用于分析肠道样本中的细菌组成(Vaahtovuo,2005)。该项研究的目的是研究动物肠道微生物菌群的特性，并探索不同的饲料原料和添加剂对肠道微生物区和动物机体消化率的影响。将获得的该独特的知识和信息用于揭示微生物区的菌群组成与肠道健康状况和动物生产力之间的关系。作为一个该微生物菌群强化理论可行性验证，我们提出了微生物平衡指数(MicrobialBalanceIndex,MBI)这一概念。2粪样及细菌分析为了研究正常粪便中微生物菌群的组成，分别从224头10周龄仔猪和256头16～20周龄生长猪中采集各头试验猪的粪便样本，样本采集后不进行混合。试验猪饲养在正常的生产条件下，同时参加饲喂数种不同饲料组成的饲养试验。试验猪分数个饲喂组(其中试验仔猪分17个组，生长猪组分16组)，每组有12～18头猪。试验时测定每组猪的平均日增重(DWG)。另外，为研究水解啤酒酵母ProgutTM(芬兰SuomenRehu公司生产)对粪便中微生物菌群和动物生长的影响究，特收集60头10周龄仔猪的粪便样本。试验时将这60头10周龄仔猪分成5个饲喂组，每组12头；其中2个组的仔猪从5周龄开始饲喂常规的断奶料(对照料)，另3个组的仔猪饲喂相同的断奶料，但在断奶料中添加水解酵母(试验料)。分别测定各组仔猪的平均日增重。粪便样本采集后，进行细菌细胞分离，并利用一种基于FCM、16S-rRNA杂交技术和DNA染色技术的方法进行分析(Vaahtovuo,2005)。粪样保存在磷酸盐缓冲盐水(Phosphate-BufferedSaline,PBS)中，细菌用离心法分离。细菌细胞用多聚甲醛定型后，再用PBS冲洗数次，重新保存在含50%乙醛的PBS中。定型后的细菌细胞置于-20℃冰箱保存，用能作为各种细菌属和细菌群靶子的核苷酸探针进行分子杂交(Lay,2005;Sghir,2000;Suau,2001)，随后根据SYTOX誖DNA染色法(分子探针，美国俄勒冈州尤金公司生产)染色，用流式细胞术分析。此外，统计总细菌数(DNA染色的细菌数量)，以综合方式描述微生物菌群的MBI值可根据以下方程(专利保护)计算获得：MBI=(A+B)/(C+D)。式中：A为双歧杆菌数；B为粪球菌属细菌(FaecalibacteriumPrausnitzii)数；C为类杆菌属-卟啉菌属-普氏菌属菌群(BacteroidesPorphyromonasPrevotellagroup)的细菌数；D为肠道菌群细菌数。分别对每个样本的细菌数量和微生物平衡指数值进行统计。利用t-检验分析两个具有不等方差的独立样本集，用Pearson氏相关系数和回归分析法评估微生物平衡指数与平均日增重间的相关性，所有分析结果的显著性差异均设为P<0.05。3水解酵母对东南角水生动物的影响图1列出流式细胞术分析实例。在圆点图中，x轴表示探针杂交目标细菌的荧光点数，y轴表示DNA-染色的荧光点数。细菌分离自非DNA-染色的样本材料，已杂交的目标细菌可与样本中其他细菌区别出来。图2列出了微生物平衡指数和平均日增重间的相关性。无论是仔猪还是生长猪中，两者的相关系数均达到统计学上的显著性差异(仔猪：r=0.68,r2=0.46,P≤0.01；生长猪：r=0.68,r2=0.46,P≤0.01)。表2列出了水解酵母对仔猪微生物平衡指数和平均日增重的影响。仔猪饲喂含水解酵母的饲料后，其平均日增重和微生物平衡指数均明显提高。不过与对照组相比并没达到统计学上的显著性差异(平均日增重：P=0.07,微生物平衡指数:P=0.20)。4肠道微生物菌群的组成芬兰研究项目中所采用的流式细胞术方法能够获得有关肠道菌群的比较全面的数据。流式细胞术分析法具有快速、可靠的特点，并有很高的数值解析率(numericalresolution)。该独特的方法是建立在检测整个细菌细胞基础上的，且不依赖于会使分析结果失去真实性的细菌培养或核苷酸的提取和扩增。所获得的结果验证了肠道正常微生物菌群在动物生长过程中逐渐成长并且由某些细菌菌种及菌属按宿主动物特有的比例组成(Conway,1997)。尽管仔猪和生长猪的粪便在细菌组成上有着明显相似性，但其微生物特性同样揭露了不同年龄组间存在着明显差异。无论是仔猪还是生长猪，类杆菌属-卟啉菌属-普氏菌属菌群是肠道粪便中第一大菌群，但是，细菌数量和所占比例上的变化表明，不同年龄段仔猪在肠道微生物菌群上存在着明显的差异。随仔猪年龄的增长，类杆菌属-卟啉菌属-普氏菌属群菌、双歧杆菌和普拉梭杆菌的数量逐渐减少，而肠道细菌群的数量并未发生变化，柔嫩梭菌的数量逐渐增多，但细菌总数基本保存不变。用以分析的样本采自在正常生产条件下饲养的试验猪，且饲喂了数种不同的饲料，因此，该结果可以代表仔猪和生长猪在正常饲养条件下肠道微生物菌群的组成。肠道微生物菌群是一个极复杂的生态系统，要描述其组成是相当困难的，而用微生物平衡指数来描述则显得简洁且全面。微生物平衡指数是通过计算肠道内4种主要细菌菌种的比例获得，因此，即使是那些没有直接测定其所占比例的细菌也会影响微生物平衡指数，了解这一点是非常重要的。微生物菌群是一个具有固有平衡能力的整体，并且某些微生物菌种所占比例发生了变化不可避免地会影响其他微生物的比例。微生物平衡指数能使复杂的微生物菌群变成一个简洁易懂的概念，而且特别适用于监控肠道微生物菌群的变化。有关微生物平衡指数和动物生长之间相互关系的研究结果具有极其重要的意义，表明了肠道微生物菌群的组成对动物福利及其生产力会产生十分重要的影响。在这些饲养试验中，可以用估计得到的微生物平衡指数公正地(r2=0.46)解释平均日增重中的变异。研究表明，水解酵母能提高微生物平衡指数，促进仔猪的生长。该研究结果是一个利用日粮方法通过调整肠道微生物菌群提高动物生产力的有应用价值的实例。经常有报道，新型功能性饲料和功能性添加剂对细菌有特定的作用，但它们对整个肠道微生物菌群的重要性更应受到重视，因为肠道微生物是影响宿主动物生理和免疫状况的重要因素。本文所介绍的肠道菌群分析方法和微生物平衡指数概念将有助于评估AGP替代品对动物体内微生物的作用，并可促进基于控制和调整肠道微生物菌群的新型饲料和新型饲喂方案的开发。表1列出了粪便样本中的细菌群,仔猪和生长猪粪便中的细菌总数处于相同的水平:每克干粪样的细菌含量分别为1.5×1011个和1.4×1011个。对细菌群研究表明，类杆菌属-卟啉菌属-普氏菌属细菌的菌群是粪便中最普通的菌群，仔猪和生长猪每克粪样中的