结核病的免疫机制

结核病的免疫机制

自20世纪80年代以来，发达国家和发展中国家的疫情逐年恢复。其主要原因是耐多药结核病(MDR-TB)流行、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、器官移植及免疫抑制剂使用等所致免疫损害宿主(ICH)增多和高龄人口中机体免疫力低下等因素,使结核分枝杆菌感染难于控制。传统的理论认为,结核免疫属于Ⅳ型变态反应,为细胞性免疫。随着结核免疫研究的深入开展,越来越多的学者发现结核的发病与体内的巨噬细胞、辅助性T淋巴细胞及相关细胞因子密切相关。本文作者对几年来结核免疫及结核免疫治疗的进展综述如下。1结核菌细胞的t细胞毒性结核杆菌由于其表面结构的特殊理化特性而能在巨噬细胞胞质内生长繁殖。在细菌胞质膜的外层为坚硬的肽聚糖(PG)层,有许多蛋白质与PG有关,并存在于细菌胞质膜与PG层之间,其中有些具有免疫原性,在PG层以外,PG通过磷酸二酯与阿拉伯糖-半乳糖多聚物(AG)以共价健连接。在AG以外为分枝酸,分枝酸是一种大分子(C60~C90)的分枝链脂肪酸,常为同系化合物的混合物,并与AG层的远端相连,表面结构的最外层为糖脂、多与分枝酸相连。海藻二糖的PG、AG和分枝酸盐复合物也与细胞壁结构相连。另一重要的细胞壁成分为酰化海藻糖-2′-硫酸盐,这一成分可能在细菌的毒力上起重要作用,因为多数有毒力的结核杆菌能产生酸性硫脂与细菌灭活巨噬细胞中吞噬体的作用有关。另外,结核菌细胞有一种贯穿胞质膜到细菌表面的不均一的高分子阿拉伯甘露聚糖脂(LAM)成分,有毒结核菌LAM的阿拉伯糖末端连接着数个甘露糖残基称为Man-LAM;而快速生长的非致病性分枝杆菌LAM的阿拉伯糖末端连接的是肌醇磷酸盐,此种差异导致两者对巨噬细胞的不同反应性。结核菌释放的蛋白可分为3种:分泌蛋白、细胞壁蛋白和细菌裂解释放出的细胞浆蛋白,目前研究重点为前二者。结核菌的保护性抗原存在于活跃生长细菌的分泌物即早期培养渗滤物(ST-CF)中,其中已纯化和鉴定的有10种左右,与机体免疫应答密切相关的主要成分有:富含脯氨酸复合物(45000~47000)为机体迟发型变态反应和抗体应答的靶抗原,AG85复合物(30000~32000),含A、B、C3种不同的细胞外壁抗原,属粘性分子,在巨噬细胞摄取结核菌时起重要作用。此外尚有分泌抗原MPT51(27000)、MPT64(26000)及ESAT-6(6000)(仅有毒菌分泌,BCG菌不分泌)等。从结核菌分泌的蛋白混合物中分析T细胞识别的抗原甚为困难。目前采用SDS分离蛋白混合物,将胶切割分别进行电泳后将蛋白洗脱到缓冲液中,除去SDS,得到分成几个较窄分子量范围的蛋白组分,用以刺激T细胞转化和分泌细胞因子。初步鉴定出来的几个重要T细胞抗原有:特异性MPT64、AG85复合物和相对分子质量为6000的ESAT-6蛋白,后者为T记忆细胞识别的主要靶抗原。还有一个24000~30000抗原,如豚鼠结核感染时引起高反应性的靶抗原。但这些抗原是诱导保护性细胞介导免疫力还是也可以引起损伤性迟发型变态反应,尚不很清楚。2结核杆菌kra越来越多的证据表明,活性氮自由基(RNI)在鼠巨噬细胞抗结核中起重要作用。NO的合成受IPS、IFN-γ、TNF、IL-1、IL-6等多种细胞因子激活,IL-4、IL-10和TGF-β则起抑制作用。在人的巨噬细胞中,RNI的作用尚无定论,其激活机制也比小鼠中的复杂,受多种细胞因子调控。TNF、IFN-γ、GM-CSF和1,25-羟基维生素的联合应用可以增加NO合成,而TGF-β、IL-10和前列腺素可以起到抑制作用。巨噬细胞可杀伤结核杆菌,但另一方面,结核杆菌又会逃避杀伤作用,从而在胞内存活。Sturgill-Koszyoki等发现,在巨噬细胞中,含有鸟型分枝杆菌吞噬体的pH为6.3~6.5,很难继续酸化;通过免疫电镜证实,这些吞噬体含有溶酶体的膜蛋白CAMP-1,却缺少与酸化有关的质子ATP酶。这一结果推出两种可能结论:①含有结核杆菌的吞噬体能选择性地抑制与带有质子ATP酶的溶酶体的结合;②这些吞噬体快速从带有质子ATP酶的溶酶体中逃逸出来。Mcdonough等证实了后一种可能,他发现结核杆菌H37Rv和H37Ra可以从已融合的吞噬溶酶体逃逸到未融合的吞噬体中或胞质中,而被吞噬的BCG则没有这种现象。这是不是毒力结核杆菌可能在人巨噬细胞中长期存活而不被杀死的主要原因,尚需探讨。结核分枝杆菌感染的巨噬细胞在刺激结核特异性CD4+T细胞增殖和产生细胞因子方面的能力大大降低,结核分枝杆菌感染能使巨噬细胞MHC-Ⅱ抗原递呈分子表达下调、抗原递呈能力下降,并且使巨噬细胞对IFN-γ作用不敏感。因此,结核分枝杆菌能在多环节上调控巨噬细胞功能,使其不能产生适度的T细胞反应。另外,结核分枝杆菌进入巨噬细胞的途径也将影响其随后在巨噬细胞内的命运。从目前的研究来看,至少有7~10个典型的巨噬细胞受体(CR1、CR3、CR、甘露糖受体、清道夫受体、CD14、CD43,还有3个不同的Sp-A受体等)可以识别、结合并介导结核分枝杆菌进入巨噬细胞。这就决定了结核分枝杆菌与巨噬细胞的初始相互作用是及其复杂的,而且肯定会对后续的生物学事件产生深刻的影响。3th1、th2细胞及th3T细胞根据其抗原识别受体的不同,分为包含α、β链的α/βT细胞和包含γ、δ链的γ/δT细胞。近年来,根据T细胞分泌细胞因子功能的不同,又将α/βT细胞中的CD4细胞分为Th1、Th2和Th0细胞。Th1细胞分泌TL-2、INF-γ和TNF-β等细胞因子,这些细胞因子能激活巨噬细胞提高巨噬细胞杀伤细菌的功能,也引起迟发型变态反应;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子,这些细胞因子主要激活体液免疫系统,包括B细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞等;Th0细胞是Th1、和Th2细胞的前体细胞,可以向这两种细胞转化。Surcel等从活动性结核患者和健康人群中分离外周血单个核细胞,发现他们的IFN-γ分泌细胞(即IFN-γ样细胞)数量没有显著差别,而结核患者IL-4分泌细胞(即Th2样细胞)数量增多,IL-4分泌增加。IL-4的增加,可以解释结核患者抗体的增加。但Zhang等的研究结果却有些不同,他发现结核患者外周血单个核细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2降低,mRNA表达也降低,而Th2型细胞因子IL-4、IL-10、IL-13却未改变,推测结核病的迁延不愈可能与Th1细胞的反应性降低有关,而不是Th2细胞功能增强的缘故。成功的抗结核治疗后,Th1细胞的低反应性也随之消失。结核患者中通常存在保护性的蔸细胞免疫低下,CD4/CD8比值低下,而体液免疫亢进,可能与Th1与Th2细胞分泌细胞因子失衡有关。调整失衡,结核病也就有可能趋于好转。目前众多的学者正在努力探索调整这种失衡的办法,以期迟到治疗结核的目的。上述两位学者结果不同,可能是结核患者处于不同病期。γ/δT细胞是近10多余年来人们新认识的一种T细胞亚群,绝大多数表达CD3+、CD4-、CD8-。γ/δT细胞的结构与功能目前还不清楚,但该细胞在TCR(淋巴细胞表面抗原识别受体)结构、识别抗原并活化及产生细胞因子等方面与α/βT细胞亚群有着许多共同特征。虽然大多数γ/δT细胞缺少CD4和CD8抗原,但是却对结核杆菌抗原有反应。在体外用结核杆菌溶解物刺激从健康人分离出来的白细胞,发现其中的γ/δT细胞比例由不足10%增加到40%以上。Pfeffer等证实γ/δT细胞主要对(1.5~3.0)×103的小分子非肽类抗原起反应,这对于含有大量脂类的结核杆菌意义重大。人类γ/δT细胞能被一类含磷非肽类抗原刺激,明显不依赖任何一种抗原递呈限制系统。这些含磷配体包括异戊二烯基焦磷酸-核苷酸交联物都是结核分枝杆菌含量丰富的,含磷配体刺激表达的γ/δT细胞能稳定的产生IFN-γ,表达颗粒依赖性结核分枝杆菌杀灭活性。由于γ/δT细胞在皮肤、黏膜上皮等部位分布较多,因此可作为机体抵抗外界病原菌的第一道防线,针对启动反应的抗原可能是研制更有效结核疫苗的有利靶点。根据分泌细胞因子的不同,γ/δT细胞也分为Th1和Th2细胞。在细胞内细菌感染时,如结核杆菌,γ/δT细胞产生IL-2和IFN-γ,表现Th1的作用;而在细胞外寄生虫感染时,γ/δT细胞则产生IL-4、IL-5和IL-10,刺激B细胞,表现Th2的作用。IL-10反过来也可抑制γ/δT细胞的增殖和产生IFN-γ。然而,小剂量结核杆菌注射小鼠时,γ/δT细胞所起作用与大剂量注射时的保护作用不同,有学者认为小剂量时γ/δT细胞不直接参与抗结核,而是影响局部细胞的负荷,促使淋巴细胞和单核细胞流入,增加炎性细胞浸润,不起保护作用,反而引起组织损害。因此,γ/δT细胞在抗感染中的作用是双向的。4th1细胞型反应巨噬细胞和T细胞的协同作用,在通过抗原特异性DTH反应来消灭结核杆菌是必需的。首先活化巨噬细胞与MHCⅠ类或Ⅱ类分子或者与非多态性类似MHC蛋白(即CD1)协同作用,将分枝杆菌抗原呈递至T细胞内。巨噬细胞衍生出的细胞因子可作为抗原特异性T细胞的协同刺激分子,起着重要的作用。而后,活化T细胞产生的细胞因子再进一步地调节巨噬细胞的功能,不过其最后结果则可能是抑制或者是增强细胞内结核杆菌的生长。Th1型细胞因子(即IL-2、IFN-γ等)能增强抗原呈递过程,并且能刺激感染巨噬细胞中的抗菌反应。Th2细胞型反应,可以限制炎症反应,并使感染部位的组织损伤减少至最小的程度。巨噬细胞产生的IL-2能增强IFN-γ的产生,有利于Th1细胞的生成,增强抗原特异性T细胞和自然杀伤细胞毒作用。5治疗结构调查目前结核的治疗虽然很成功,但仍需要至少6个月的疗程。而且对一些慢性、难治性结核的疗效不甚理想,尤其是结核并发HIV、耐多药结核(MDR-TB)及普通化疗引起严重肝、肾副作用的出现,普通的抗结核药物已不能使用时,免疫疗法就显得尤为必要。通过改善免疫功能,可达到治疗结核的目的。5.1免疫活性疫苗近年来核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫的研究成为世界瞩目的防治传染病的新热点。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成,将其直接导入机体细胞后,并不与宿主染色体整合,而是通过宿主细胞转录系统表达蛋白抗原,诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的。1994年,英国的Lowrie等和Silva等首先报道了以麻风分枝杆菌65000热休克蛋白(hsp65)基因的质粒DNA肌肉注射免疫小鼠,然后用结核分枝杆菌或卡介苗(BCG)攻击,结果细胞免疫功能显著增强,肝脏菌落形成单位(CFU)显著减少,表明DNA疫苗与常规BCG疫苗一样有保护作用。1996年美国的Huygen等首次报道用结核分枝杆菌Ag85编码基因的质粒DNA免疫小鼠,可诱导小鼠产生很强的细胞和体液免疫反应,抵御活结核分枝杆菌和BCG的攻击。Lozes等和Montgomery等分别用结核分枝杆菌Ag85A、Ag85和Ag85C编码基因的质粒DNA,100μg肌肉注射6~8周龄的雌性BALB/c和C57BL/6小鼠3次,每次间隔3周,第3次注射后3周将鼠杀死。结果用Ag85A质粒DNA免疫的BALB/c和C57BL/6小鼠的脾细胞培养上清中,IL-2、IFN-γ和TNF-α水平显著高于BCG免疫鼠。Lozes等证实Ag85BDNA质粒在不同的小鼠中可以产生不同的免役效果,对C57BL/6小鼠可以产生与Ag85A类似的效果,而对BALB/c小鼠却无效。而Ag85CDNA质粒对小鼠无保护作用。1999年Tanghe等报道以结核分枝杆菌磷酸盐特异转运系统(PstS)编码基因的3个质粒DNA、PstS-1、PstS-2和PstS-3免疫雌性C57BL/6鼠,结果每个质粒NDA均产生高水平的抗原特异性抗体和Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ,用结核分枝杆菌H37Rv攻击后,可见只有Pst-3DNA免疫鼠的脾和肺细菌CFU数显著减少。1997年Lowrie等的研究表明相对分子质量为6000的早期分泌蛋白(ESAT-6)的质粒DNA免疫小鼠可产生保护性,也可作为结核病DNA疫苗的候选者。Kamath等比较几种分泌型DNA疫苗的保护效率后发现,这些疫苗表现出等级性。Ag85B最为有效,ESAT-6次之,最后为MPT64,三者联合免疫的保护性大于单一DNA疫苗的保护性。5.2立足于免疫治疗母牛分枝杆菌于1964年首次从牛乳腺中分离是对人畜无致病性的快速生长菌。长期以来未曾引起人们的重视。20世纪80年代后期,Stanford等报道了用母牛分支杆菌死菌悬液作结核病免疫治疗剂,有助于提高免疫细胞活性,消除巨噬细胞内顽固的结核杆菌。国内学者王国治等近年的基础研究也有类似发现。WHO在20世纪90年代结核病研究和发展战略规划中提出化疗与免疫疗法相结合,母牛分枝杆菌菌苗是此规划中推荐的唯一免疫治疗剂。张立群等观察了母牛分枝杆菌对结核病小鼠Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶表达的影响,发现母牛分枝杆菌调节结核病小鼠免疫的可能机制是启动Th1应答,抑制Th2应答,激活诱导型一氧化氮合酶活性,增强机体保护性免疫。庄玉辉等发现用母牛分枝杆菌能刺激T淋巴细胞增殖