枸杞多糖对uva辐射致体外培养成纤维细胞损伤的保护作用

枸杞多糖对uva辐射致体外培养成纤维细胞损伤的保护作用

随着臭氧层的逐渐减小，人类接触的紫外强度不断增加。过度暴露于紫外线辐射与多种健康问题有关,最常见的是皮肤癌和白内障,因此,由紫外线所引起的疾病负担不断增加。以往研究多集中于中波紫外线对人皮肤的损伤,而对长波紫外线(UVA,320~400nm)的研究较少。在阳光紫外辐射中,UVA占紫外辐射总能量的95%。与中波紫外线相比,UVA具有更强的穿透力,可达到皮肤的真皮层,引起体外培养皮肤成纤维细胞脂质过氧化损伤。同时,UVA在皮肤光老化的发生和发展中也起着重要作用。UVA照射细胞后,产生各种氧自由基,通过引起脂质过氧化而损伤多种细胞膜相结构,进而引发细胞凋亡和基因的改变或突变。为减轻紫外线对人体的损伤,除了遮盖皮肤以防紫外线照射外,应用抗氧化剂已成为人们的必然选择,寻找更为有效的抗氧化、抗紫外线辐射剂更是成为目前的研究热点。枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是从茄科植物宁夏枸杞中提取出来的生物活力多糖,有研究表明,它具有抗氧化、清除氧自由基的作用。笔者以体外培养人皮肤成纤维细胞为研究对象,在体外成功建立成纤维细胞UVA损伤模型,观察枸杞多糖对UVA损伤成纤维细胞的保护作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1皮肤正常年龄要求取自无菌状态下“包皮环切术”所切除的正常皮肤,要求供皮者年龄为10~30岁,无瘢痕体质。将皮肤置于75%的乙醇中漂洗数次,迅速浸入含有低浓度双抗的PBS中。1.1.2u3000试剂UVA型紫外辐射计(北京师范大学光电仪器厂生产,波长范围320~400nm,波峰365nm),UVA灯管,MK3型酶标仪(Lab公司),722型分光光度计。LBP(纯度为66.7%,购于宁夏中药厂),用DMEM培养基配制,现用现配,过滤除菌。DMEM培养基(美国Sigma公司),胎牛血清(Gibico公司),胰蛋白酶(美国AMORESCO公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Sigma公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒均购自南京建成生物工程公司。1.2方法1.2.1细胞培养及培养皮肤在无菌条件下去除皮下组织,漂洗,剪成0.5cm×0.5cm,置于培养皿中,加入0.25%的胰酶消化过夜。次日分离表、真皮。采用“植块培养法”培养,培养基为DMEM培养基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素钠、100mg/ml硫酸链霉素),于37℃、5%CO2培养箱中培养,待成纤维细胞生长至约80%融合时,按体积比为1∶2的胰酶∶EDTA消化细胞,按1瓶细胞传代成3(4)瓶进行传代培养。实验用细胞为处于对数生长期第3~8代细胞。1.2.2uva动态照射法取传代纯化后指数生长期的成纤维细胞,调节细胞密度为5×104个/ml,接种于96孔板上,每孔100μl,随机分为6组,即正常对照组、UVA模型组、UVA+0.1mg/mlLBP组、UVA+0.2mg/mlLBP组、UVA+0.4mg/mlLBP组、UVA+0.8mg/mlLBP组,每组设6个复孔。培养24h后,UVA模型组单纯给予紫外线照射,各枸杞多糖保护组于紫外线照射前2h加入不同浓度的LBP,对照组和模型组只加入相同量的培养基,紫外线照射前吸取培养基,用D-hanks液清洗2次,并铺上一薄层D-hanks液,在紫外灯下照射,以2支平行UVA灯管作为UVA光源,距离台面15cm,辐射强度为1mW/cm2,照射时间为2400s,总剂量为2.4J/cm2。照射后各孔重新加入原来的培养液,再加入5mg/ml的MTT20μl,继续培养4h,弃去上清液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl,37℃条件下振荡15min,用酶标仪在492nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。1.2.3uva的测定取指数生长期细胞,调节细胞密度为1×106个/ml左右,接种至6个直径为100mm的培养皿中,每皿5ml。随机分为6组,即正常对照组、UVA模型组、UVA+0.1mg/mlLBP组、UVA+0.2mg/mlLBP组、UVA+0.4mg/mlLBP组、UVA+0.8mg/mlLBP组。各枸杞多糖保护组于紫外线照射前2h加入不同浓度的LBP,正常对照组和U-VA模型组只加入相同量的培养基。紫外线照射前吸取培养基,用D-hanks液清洗2次,并铺上一薄层D-hanks液,在紫外灯下照射,以2支平行UVA灯管作为UVA光源,距离台面15cm,辐射强度为1mW/cm2,照射时间为2400s,总剂量为2.4J/cm2。照射完毕后,把原来吸掉的培养基重新加入各培养皿中,继续培养4h,离心收集细胞,用冷PBS清洗2次,超声破碎细胞,取裂解液一式3份,严格按照试剂盒说明书检测SOD活力、MDA含量。1.2.4uva的测定取指数生长期细胞,调节细胞密度为1×106个/ml左右,接种至6个直径为100mm的培养皿中,每皿5ml。随机分为6组,即正常对照组、UVA模型组、UVA+0.1mg/mlLBP组、UVA+0.2mg/mlLBP组、UVA+0.4mg/mlLBP组、UVA+0.8mg/mlLBP组。各枸杞多糖保护组于紫外线照射前2h加入不同浓度的LBP,正常对照组和UVA模型组只加入相同量的培养基。紫外线照射前吸取培养基,用D-hanks液清洗2次,并铺上一薄层D-hanks液,在紫外灯下照射,以2支平行UVA灯管作为UVA光源,距离台面15cm,辐射强度为1mW/cm2,照射时间为2400s,总剂量为2.4J/cm2。照射完毕后,把原来吸掉的培养基重新加入各培养皿中,继续培养18h,取上清液一式3份,严格按照试剂盒说明书检测其中LDH漏出量。1.3多样性比较的统计学处理用SPSS11.5软件对结果进行统计分析,各组数据以x±s表示,多样本均数间比较采用One-wayANOVA检验,组间的两两比较采用SNK检验,以P<0.05为差异有统计学意义。相关分析采用秩相关分析。2结果2.1组患者a值比较对照组、UVA+0.1mg/mlLBP组、UVA+0.2mg/mlLBP组、UVA+0.4mg/mlLBP组、UVA+0.8mg/mlLBP组、UVA模型组的A值分别为0.2785±0.0308、0.2248±0.0266、0.2295±0.0144、0.2620±0.0269、0.2730±0.0102、0.2278±0.0186。UVA模型组A值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),说明损伤模型制作成功。UVA+0.4mg/mlLBP组和UVA+0.8mg/mlLBP组A值高于UVA模型组,差异均有统计学意义(P<0.01)。UVA+0.1mg/mlLBP组和UVA+0.2mg/mlLBP组A值低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。且随着LBP剂量的增加,A值呈升高趋势(r=0.658,P<0.01)。2.2mda含量、ldh漏出量表1可见,与对照组比较,UVA模型组细胞内SOD活力降低,MDA含量升高,LDH漏出量升高;UVA+0.1mg/mlLBP组、UVA+0.2mg/mlLBP组、UVA+0.4mg/mlLBP组MDA含量、LDH漏出量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着LBP剂量的增加,细胞内SOD活力呈升高趋势(r=0.655,P<0.01),MDA含量呈降低趋势(r=-0.807,P<0.01),LDH漏出量呈降低趋势(r=-0.949,P<0.01)。3uva对细胞增殖活力和抗氧化损伤作用阳光紫外线中所含的UVA则具有很强的穿透作用(大约1mm),这种作用不仅对角质形成细胞有影响,更为严重的是,它还可影响位于真皮层的成纤维细胞,影响皮肤胶原合成,进而引起皮肤光老化。紫外线防护剂是一类能够清除紫外辐射所产生的活性氧的物质,能够保护皮肤对抗紫外线的氧化损伤,延缓皮肤衰老。本研究选择茄科植物宁夏枸杞为保护剂,在体外成功制作紫外线损伤模型,观察枸杞多糖对紫外辐射致体外培养成纤维细胞增殖、氧化损伤、细胞膜损伤的保护作用。活细胞(特别是增殖的细胞)能量代谢旺盛,线粒体能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原为蓝色的结晶,沉积在细胞内和细胞周围,形成的结晶量与增殖的细胞数成正比。DMSO可溶解结晶,用酶联免疫检测仪在492nm波长处测定其A值,可间接反映细胞增殖活力,在一定范围内,结晶的形成量与活细胞数呈正比。本次实验采用MTT法检测LBP对UVA辐射细胞活力的作用,结果发现,UVA模型组A值低于对照组(P<0.01),而除了UVA+0.1mg/mLBP组A值低于UVA模型组外,其余各枸杞多糖保护组A值均明显高于UVA模型组。提示UVA可以造成体外培养人皮肤成纤维细胞增殖活力降低,而枸杞多糖可以剂量依赖性地增加细胞的增殖活力。SOD可催化超氧阴离子(O2·)歧化为H2O2和O2,是活力最强的自由基清除剂之一,可以为细胞提供一道免受自由基损伤的保护屏障。同时,由于生物膜具有脂质双分子层结构,自由基攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸而造成脂质过氧化,进而对膜产生强烈的破坏作用,并产生脂质过氧化产物,如醛基(丙二醛)、酮基、羟基等。根据产生的脂质过氧化产物的量,可间接判断脂质过氧化程度。测定MDA含量及SOD活力可间接反映机体抗氧化损伤和清除自由基的能力。本次实验发现,UVA模型组SOD活力低于对照组,而MDA含量高于正常对照组,表明紫外线可以造成成纤维细胞脂质过氧化。而各枸杞多糖保护组可以剂量依赖性地增加SOD活力,降低MDA含量,表明枸杞多糖具有对抗UVA对成纤维细胞的氧化损伤作用。LDH属于细胞内酶,当细胞受到外来刺激或致伤因素影响后,可大量释放或漏出LDH到细胞外,提示细胞膜受损。因此,测定LDH漏出量可作为细胞损伤的标志,细胞外L