微生物溶菌酶的酶学性质及抑菌性分析

微生物溶菌酶的酶学性质及抑菌性分析

溶菌酶，又称异质醇胞壁酶或多酚醛基总理酪氨酸酶，是一种碱性酶，能溶解细菌细胞中的糖苷含量，并能溶解微生物细胞。这是该酶的抗菌、消炎和抗菌作用。根据溶菌酶的一级结构、分子量和生物来源,可以将溶菌酶分为6种类型,即:噬菌体T4溶菌酶(phage-type)、植物溶菌酶(plant-type)、微生物溶菌酶(bacteria-type)和3种动物型溶菌酶,即溶菌酶C型(chicken-lysozymetype)、G型(goose-type)和I型(invertebrate-type)。目前已经商业化应用的溶菌酶多由蛋清中提取,其最适作用温度为50℃,最适pH值为7.0,当pH值在1.2～11.3范围内剧烈变化时,依然能保持较高的结构稳定性及热稳定性,已广泛应用于医药、食品等行业。但该酶主要溶解革兰氏阳性菌,因而限制了它的进一步应用,且国内蛋清溶菌酶年产量不足50t,特别是高活性的溶菌酶供应还不能满足日益增长的需求。微生物溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段,但因其较高的提取率、广泛的溶菌谱和优越的抑菌性,正日益受到研究人员的重视。微生物产溶菌酶主要有3种:N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内肽酶。在微生物的发酵液中往往存在许多溶菌作用相关因子,由于彼此之间的协同作用使其对细胞壁的溶菌能力增强。微生物溶菌酶纯品为白色、微黄或黄色晶体或不定型粉末,无臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。本试验采用微生物来源的溶菌酶,通过对溶菌酶酶学性质的研究及体外抑菌试验,为溶菌酶在畜禽疾病治疗、促进生长等方面的应用提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1微生物溶菌酶溶菌酶检测试剂盒(南京建成科技有限公司生产);微生物溶菌酶(5000U/mg,上海沈李科工贸有限公司生产);营养琼脂、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、柠檬酸(国药集团生产)。1.1.2精密ph的测定UV-2000尤尼柯UNIC紫外可见分光光度计;THZ-82水浴恒温振荡器;SE402F电子天平;PB-10精密pH计;高压灭菌锅、恒温培养、移液器等。1.1.3菌种菌种溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、哈维氏菌、沙门氏菌、啤酒酵母、黑曲霉及青霉均为实验室保存菌种。1.2测试方法1.2.1ph值对微生物酶的影响将0.1mol/L柠檬酸溶液和0.1mol/L磷酸氢二钠溶液按一定比例混合,分别配制成pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液;以无菌水配制1g/L的微生物溶菌酶溶液,进行酶活测定。以其中的最高酶活为100%,其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为相对酶活。1.2.2ph值缓冲液下最适ph值缓冲液酶活测定调节恒温水浴锅,分别设定反应温度为30、35、40、45、50、55、60、65、70℃,在最适pH值缓冲液下测定酶活,以最高酶活为100%,其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为相对酶活。1.2.3ph值缓冲液的制备称取1.000g溶菌酶,以对应的最适pH值的缓冲液定容到1L,分别在40、50、60、70、80、90℃的水浴锅中各预热2支盛有1.9mL最适pH值缓冲液的试管。然后分别加入0.1mL的溶菌酶溶液,迅速摇匀并准确计时2min和5min,取出后迅速置于冰水浴中,于最适pH值和温度条件下测定酶活,以未经高温处理的稀释酶样酶活为100%,其他条件下的酶活占未处理酶样酶活的百分数即为相对酶活。1.2.4ph值对酶活的影响称取1.000g溶菌酶样品,加入1L无菌水,搅拌均匀,在最适pH值和最适温度条件下测定酶活作为对照。取0.1mL溶菌酶溶液(1g/L)12份,分别加入1.9mL的缓冲液,将pH值分别调到2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,于40℃水浴锅中保温2h,迅速取出放入冰水浴,分别于最适pH值和温度条件下测定酶活。以对照组所测得的酶活为100%,其他条件的酶活占对照组酶活的百分数即为相对酶活。1.2.5微生物溶菌酶活性测定将各供试细菌在营养肉汤中培养24h,啤酒酵母与霉菌孢子于液体土豆培养基中培养48h后,振荡均匀,在无菌操作下,分别取150μL菌液与15mL固体培养基制成倾注平板,贴上灭菌的圆滤纸片。各取5μL浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1、1.5、2.0mg/mL的微生物溶菌酶溶液,滴加在滤纸片上,37℃培养24h,测定最低抑制浓度。每个菌种试验平行3次。2结果与分析2.1ph值对微生物溶菌酶活性的影响在37℃、不同pH值的缓冲液中测定的酶活见图1。由图1可以看出,微生物溶菌酶随着pH值的不断增大,酶活呈现先上升后下降的趋势,在pH值5.0～7.5之间可保持80%以上的酶活。而在pH值7.0左右的时候达到了最高峰,因此微生物溶菌酶的最适pH值为7.0。2.2反应体系温度对微生物溶菌酶活性的影响调整各个微生物溶菌酶溶液pH值为7.0,在不同温度下测得的酶活变化情况见图2。由图2可以看出,微生物溶菌酶的酶活随着反应体系温度的上升,呈现了一个先上升后下降的趋势,原因是起初温度的上升加快了分子运动,使反应速度随之提高,而达到40℃后,随温度的升高,溶菌酶逐渐失活,引起酶催化活性的下降。故该酶的最适反应温度为40℃。2.3in后酶活变化微生物溶菌酶溶液经由不同温度分别处理2min及5min后,酶活变化曲线如图3。由图3可以看出,微生物溶菌酶在湿热处理2min后酶活基本不变,而湿热处理5min后,温度低于75℃时,仍可保持80%以上的酶活。2.4酶活变化曲线微生物溶菌酶经由不同的pH值条件处理2h之后,酶活变化曲线见图4。由图4可以看出,在各pH值环境中处理2h后,微生物溶菌酶在pH值2.5～6.0左右的酶活,保持在100%以上,较稳定。2.5革兰阴性菌对微生物的抑制作用利用滤纸片扩散法测定了不同浓度的微生物溶菌酶对8种细菌及3种真菌的最低抑制浓度(表1)。由表1可知,微生物溶菌酶不仅对革兰氏阳性的溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,对大肠杆菌、哈维氏菌、溶藻弧菌、沙门氏菌等阴性菌也具有很强的抑制作用,尤其是嗜水性气单胞菌对该微生物溶菌酶最为敏感,最低抑制浓度为0.005mg/mL,而对副溶血弧菌较不敏感。此外,对啤酒酵母也有抑制作用,最低抑制浓度为2.0mg/mL。表明微生物溶菌酶具有广谱抑菌性,并且对革兰氏阴性菌(G-)具有比革兰氏阳性菌(G+)更强的抑制效果。这可能是因为微生物溶菌酶与革兰氏阴性菌外层成分的脂多糖无亲和性从而无法阻止溶菌酶的渗透,并且革兰氏阴性菌肽聚糖层薄,因而溶菌酶能很好地水解革兰阴性菌细胞壁并抑制其生长。此外,该微生物溶菌酶对啤酒酵母也具有一定的抑制效果,而对黑曲霉和青霉无抑制作用。3微生物溶菌酶的温度及时间(1)微生物溶菌酶的最适作用pH值:溶菌酶随着pH值的不断增大,酶活是呈现先上升后下降的趋势,在pH值5.0～7.5之间可保持80%以上的酶活,而在pH值7.0左右酶活达到最高峰。(2)微生物溶菌酶的最适作用温度:溶菌酶的酶活随着反应体系温度的上升呈现了一个先上升后下降的趋势,到达40℃左右的时候酶活达到最高,超过40℃后酶活则开始下降,该酶的最适反应温度为40℃。(3)微生物溶菌酶的湿热稳定性:微生物溶菌酶溶液湿热处理2min后酶活基本不变,而湿热处理5min后,温度低于75