响应面法优化提取啤酒酵母泥中海藻糖的工艺研究

响应面法优化提取啤酒酵母泥中海藻糖的工艺研究

母膜的核心主要由糖和蛋白质组成。其中，三氧化二氮是由半硝基反应反应的非对称双糖。作为一种应急代谢物，海藻糖可以在恶劣环境中对动物、植物和微生物的抗性营养不足、高温、低温、干燥、高渗和中毒等药物的抗性物质进行分解和保护。特别是在冰冻、干燥和高渗等特殊环境下保护生物糖。该指南已在食品、药物和保健品等领域得到广泛的应用。我国啤酒的年生产量已达4000万吨,废酵母泥是啤酒生产的主要副产物,约占啤酒产量的0.15%左右,其处理方式多为干燥后加工成饲料或者以废弃物堆放,造成资源极大浪费和环境污染。因此,越来越多的人关注于如何提高废酵母泥的附加值。啤酒废酵母泥是提取海藻糖的重要原料,网络出版地址目前对于海藻糖的提取方法主要有高温法、微波法、醇提法及水煮法。本文中利用醇提法制备啤酒酵母中的海藻糖,结合单因素实验和响应面法,对海藻糖的制备条件进行优化,为酵母泥的综合利用提供实验依据。1实验1.1实验试剂和设备啤酒酵母(青岛啤酒济南分厂);无水乙醇(分析纯,康德化工公司);蒽酮和海藻糖(分析纯,Ruitaibio公司);氯化钠(分析纯,上海化学试剂公司);浓硫酸(分析纯,广成化学试剂公司)。723型可见分光光度计(上海分析仪器总厂);DK-8D型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);YP2102型电子天平(上海光正医疗仪器有限公司);TGL16M型离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)。1.2实验方法1.2.1啤酒酵母泥制备颗粒、汁、冷却、干燥、冷却海藻糖的生产提取过程共由15步组成,其工艺流程为:啤酒酵母泥→反复水洗→离心→干燥→粉碎→过80目筛→乙醇浸提→冷却离心→上清液浓缩去醇→超滤→活性炭脱色→浓缩→结晶→干燥→成品。1.2.2硫酸-酮试剂吸收剂的制备分别取海藻糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL于试管中,加水至1.0mL,再加入4mL硫酸-蒽酮试剂。快速摇匀后置于沸水浴中煮10min,取出迅速放入冷水中冷却,以0mL管为空白对照,测定620nm下的吸光度值(OD620)。以海藻糖质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制海藻糖标准曲线如图1所示。1.2.3单因素实验13醇提时间对海藻糖提取率的影响取干酵母粉2g,加入体积分数50%的乙醇20mL,在80℃下分别提取0.5、1.5、2.0和2.5h。24醇提温度对海藻糖含量的影响取干酵母粉2g,加入50%体积分数的乙醇20mL,分别在50、60、70、80和90℃条件下提取1.5h。32乙醇体积比对海藻糖含量的影响取干酵母粉2g,分别加入体积分数分别为30%、40%、50%、60%和70%的乙醇溶液20mL,在80℃下提取1.5h。1.2.4响应面优化实验在单因素实验的基础上,根据中心组合设计原理,以海藻糖得率为指标,设计3因素3水平的响应面实验,因素水平编码见表1,用DesignExpert软件进行数据分析,确定最优提取工艺条件。2结果与分析2.1标准海糖含量曲线图1是海藻糖的标准曲线图,由此曲线可得方程y=-0.0075x+0.0192。2.2单因素实验2.2.1醇提时间对海藻糖得率的影响按照1.2.3给出的实验方法首先探讨醇提时间对提取得率的影响,图2为提取时间对海藻糖提取量的影响图,由图2可知,随着醇提时间的增加,酵母海藻糖的得率呈现先升后降的趋势,在醇提时间为1.5h时达到最大。原因可能是在一定的醇提时间内,海藻糖由胞内渗出基本达到平衡,过度延长醇提时间后,由于加热时间过长,导致酵母细胞中其它非目标物质的分解和溶出,从而阻碍海藻糖的继续提取,减少了海藻糖的质量分数,影响了提取得率。因而选取醇提时间为1.5h。2.2.2醇提温度对海藻糖得率的影响按前述方法研究醇提温度对海藻糖得率的影响,结果见图3。由图3可知,随着醇提温度的增加,醇提温度对酵母海藻糖得率的影响呈先升而后降的趋势,在80℃时海藻糖的得率达到最大。这可能是由于温度升高导致溶液黏度减小,分子运动速率加快,有利于海藻糖的渗透。但在过高的温度下,细胞内结构遭受损坏和挤压,影响了海藻糖的溶出,导致得率降低。因而选取醇提温度为80℃。2.2.3乙醇的体积分数对海藻糖得率的影响图4为乙醇体积分数对海藻糖得率的影响图,由图4可知,乙醇体积分数对酵母海藻糖得率的影响呈先升而后降的趋势,在乙醇体积分数为50%时海藻糖得率达到最大。但乙醇的体积分数过高会严重影响海藻糖的最终得率,这可能是高含量的有机溶液造成了较大渗透压,影响海藻糖从细胞膜中的溢出。故选取乙醇体积分数为50%。2.3rm对海藻糖提取率的工艺参数进行了优化2.3.1结果分析和显著性分析RSM实验结果如表2所示,通过DesignExpert分析软件进行回归方程的建立,得到方差分析结果如表3所示。从表3可以看出,根据海藻糖得率所建立的回归模型,设计差异极显著(p<0.01),而且该模型的复相关系数R2=0.9386,实验误差较小,实验的失拟项小且信噪比RSN大于8.954,说明此模型与实际模型拟合较好,且具有较好的预测作用,因此可以用该回归模型,代替真实的实验对实验结果进行分析。如表3所示,由p值大小可知,在所选各因素水平范围内,对结果影响大小的顺序为乙醇体积分数>醇提温度>醇提时间。一次项θ、t、φ都不显著(p>0.05),二次项θ2、t2、φ2极显著(p<0.01),交互项θt、θφ不显著(p>0.05),tφ显著(p<0.05),这表明醇提时间和乙醇体积分数之间存在显著交互作用,醇提时间和乙醇体积分数的交互作用对水解度的影响具有显著性。利用DesignExpert分析软件对表2中的实验数据进行多元拟合分析,得到酵母海藻糖得率(Y)对醇提温度θ、醇提时间t以及乙醇体积分数φ的二次多项回归方程模型为:Y=10.51+0.19θ-0.14t+0.32φ-0.34θt+0.030θφ-0.66tφ-1.03θ2-0.92t2-0.99φ22.3.2醇提温度和乙醇体积分数对海藻糖得率的影响图5、图6和图7直观地反映了醇提温度θ、醇提时间t和乙醇体积分数φ,对海藻糖提取得率的响应面的影响。由图5可知,当醇提温度在70~80℃内,醇提时间在1~1.5h时,两者存在显著的增效作用,海藻糖的得率随着醇提温度升高和醇提时间的延长而增加;而当醇提温度在80~90℃内,醇提时间在1.5~2h时,海藻糖的提取得率随着醇提温度和醇提时间的升高反而降低。由图6可知,当乙醇体积分数在40%~50%内,醇提温度在70~80℃时,海藻糖的提取得率随着醇提温度和乙醇体积分数的升高而增加;而当乙醇体积分数在50%~60%,醇提温度在80~90℃时,海藻糖的提取得率,将随着醇提温度和乙醇体积分数的升高而减少。由图7可知,当乙醇体积分数在40%~50%,醇提时间在1~1.5h时,海藻糖的得率随着醇提时间和乙醇体积分数的升高而增加;而当乙醇体积分数在50%~60%,醇提温度在1.5~2h时,海藻糖的提取得率,将随着醇提时间和乙醇体积分数的升高而减少。2.3.3响应面法提取酵母海藻糖的最优提取条件的确定对所建立的数学模型做了最优化条件分析,得到了酵母海藻糖最佳提取条件为:乙醇体积分数为52.20%,醇提时间为1.41h,及醇提温度为81.23℃。此条件下,海藻糖的理论得率为10.57%。为验证响应面法的可靠性,利用得到的最优提取条件进行酵母海藻糖的提取验证实验。为方便实际操作,选取乙醇体积分数为52%、醇提温度为81℃和醇提时间为1.4h,在此条件下进行3次平行实验,实际得到酵母海藻糖得率的平均值为10.49%,比响应面法预测值稍低。因此应用响应面法优化酵母海藻糖的提取条件,具有实际的应用价值。3海藻糖提取条件对糖得率的影响1)采用醇提法、单因素实验和响应面分析对酵母海藻糖的提取工艺进行优化,确定海藻糖提取的最佳工艺参数为乙醇体积分数52.20%、醇提温度81.23℃、醇提时间1.41h,在此条件下,海藻糖提取得率为10.57%,产品为乳白色粉末