一测多评法测定川芎、当归中4种多指标成分

一测多评法测定川芎、当归中4种多指标成分

川药和当归通常用于中药，历史悠久。川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎38,始载于《神农本草经》,列为上品,别名芎穹、西芎、抚芎等;当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根124。在化学成分上,两者均含有机酸和内酯类化合物,主要有阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A、丁烯基苯酞等,这些成分均为川芎、当归的有效成分。从功效来说,川芎偏于行气散血,当归偏于养血和血,两者常配伍治疗疾病,例如:肾气丸、麻黄汤、升麻散、四物汤、桃仁汤、佛手散等,二药伍用,互制其短而展其长,气血兼顾,养血调经、行气活血、散瘀止痛之力增强,为临床常用补血活血药对。目前多见以阿魏酸、藁本内酯等为单一质控指标同时控制川芎、当归质量的报道。Yu等建立了HPLC法快速测定川芎、当归中阿魏酸松柏酯的含量;刘晓芳等建立了包含川芎、当归在内的7种中药材中阿魏酸含量测定的方法;胡杰等建立了同时测定川芎、当归中藁本内酯含量的方法;刘云华等建立了同时测定川芎、当归药材中总阿魏酸的含量方法。采用一测多评方法同时测定同时控制川芎或当归质量的研究报道较为少见。刘云华等以丁基苯酞作为藁本内酯的替代对照品,通过两者之间校正因子的计算同时测定川芎药材中的丁基苯酞和藁本内酯的含量;张慧等测定了川芎中阿魏酸与洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯、3-正丁烯苯酞的相对校正因子,并进行了含量测定。目前未见报道有同时建立川芎、当归多指标化学成分一测多评的方法。基于川芎、当归中部分主要有效化学成分相同,且洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯对照品制备困难,而不同类型化合物之间一测多评方法已多有报道,为简化检测方法,在降低检验成本的同时,更加有效地控制川芎、当归的质量,拟按照“一测多评法建立的技术指南”技术要求,以阿魏酸为内标,建立同时测定川芎饮片、当归饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯4个化学成分含量的方法。经方法学验证,所建立的方法可用于川芎、当归的质量控制。Agilent1200型快速液相色谱仪,具有在线脱气机、输液泵、柱温箱、紫外检测器VWD、自动进样器;ThermoFisherUltiMateue4d23000高效液相色谱仪,具有在线脱气机、输液泵、柱温箱、DAD检测器、自动进样器;SartoriusCP225D电子分析天平(德国赛多利斯集团);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。1.2c73-13310、11937-2012-12复合材料对照品:阿魏酸(供含量测定用)、藁本内酯(供薄层鉴别用,纯度为95.0%)均购自中国食品药品检定研究院,批号分别为0773-9910、111737-201204;洋川芎内酯Ⅰ(纯度≥98%)、洋川芎内酯A(纯度≥98%)均购自成都普菲德生物技术有限公司,批号分别为130410、130428。Milli-Q超纯水,乙腈、甲醇为色谱纯,Merck。饮片来源:川芎饮片及当归饮片均来自北京市多家饮片生产企业,其中川芎饮片14批,酒川芎饮片10批,当归饮片16批,酒当归饮片10批。见表1。2.2溶液制备2.2.1混合对照溶液2.3方法研究2.3.1线性域研究2.3.2采用回归因子计算2.4rcf因子精密吸取混合对照品溶液1、2、6、10、15、20μL进样分析,计算以阿魏酸为内标的洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯的相对校正因子(RCF)。考察了Agilent1200、ThermoFisherUltiMateue4d130002种高效液相色谱系统和AgilentC18(4.6mm×150mm,3.5μm)、TechMateC18-STⅡ(4.6mm×250mm,5μm)、ThermoXLC18(4.6mm×150mm,5μm)3种不同品牌、规格的色谱柱,结果见表4。2.5外标法与外标法的比较取样品按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进行测定,利用“2.3.2”项下得到的平均相对校正因子计算川芎和当归中洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯含量,并分别与外标法计算得到的含量进行比较,结果见表5、6。3讨论3.1分离条件的确定考察流动相乙腈-不同浓度乙酸(0.10%、0.25%、0.50%和1.00%)、乙腈-不同浓度甲酸(0.10%、0.25%、0.50%和1.00%)、乙腈-水等9种溶剂系统对川芎、当归中化学成分分离情况,结果采用乙腈-水溶剂系统时阿魏酸出峰不好,加酸后明显变好,但以乙腈-1.00%甲酸分离效果最好;考察0.6、0.8、1.0mL·min-13种流速对分离效果的影响,结果以0.8mL·min-1时分离最好;考察35、30、25℃3种温度对分离效果的影响,结果以25℃时分离最好。3.2浓度溶剂、提取方式对洋基肥内酯提取率的影响考察30%、50%、70%甲醇和纯甲醇4种溶剂分别超声、回流30min的提取率。结果表明,超声、回流对藁本内酯、洋川芎内酯A的提取率影响不大,不同浓度溶剂对藁本内酯、洋川芎内酯A提取率大小为:纯甲醇略>70%甲醇>50%甲醇>30%甲醇;不同溶剂、不同提取方式对洋川芎内酯Ⅰ提取率影响不大;超声对阿魏酸的提取率较回流略低,相同提取方法、30%、50%、70%3种不同浓度甲醇对阿魏酸提取率差异不大,但纯甲醇对阿魏酸提取率较30%、50%、70%甲醇要小很多。结合上述考察结果,考虑到中国药典2010年版中川芎、当归的阿魏酸含量测定采用的是70%甲醇回流提取方法,最后选择70%甲醇回流30min。3.3测定阿魏酸、洋基肥、洋基肥内标及其他本两酯的含量研究中发现26批当归饮片中,多数样品未检出洋川芎内酯A,仅个别样品中检出微量川芎内酯A。因此,针对当归仅建立了以阿魏酸为内标,测定阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ及藁本内酯3种成分的一测多评方法。通过比较50份样品,结果表明:川芎中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ及藁本内酯含量远高于当归中这3个成分含量,且多数当归饮片中未检出洋川芎内酯A,而在川芎中洋川芎内酯A含量较高,与当归产生明显区别,可考虑从这一成分上对川芎、当归进行鉴别。1仪器和试剂盒1.1仪器2方法和结果2.1标准曲线及方法检出限采用AgilentZORBAXSB(4.6mm×150mm,3.5μm)色谱柱,流动相A为乙腈,流动相B为1%甲酸,梯度洗脱(0~10min,10%A→28%A;10~17min,28%A→45%A;17~25min,45%A→65%A;25~30min,65%A→100%A;30~35min,100%A;35~37min,100%A→10%A;37~45min,10%A),流速0.8mL·min-1,检测波长280nm,柱温25℃,自动进样器进样,进样量10μL。HPLC图见图1。取阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯的对照品适量,精密称定,置50mL量瓶中,加70%甲醇制成质量浓度分别为0.3176、0.6034、0.6242、1.9908mg·mL-1的溶液。分别取上述对照品溶液0.30、0.17、0.73、0.23mL,置同一5mL量瓶中,加30%甲醇至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。2.2.2回归方程的建立取饮片粉末(过4号筛)约0.2g,精密称定,置100mL具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,称定重量,置水浴上加热回流30min,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。精密吸取上述混合对照品溶液0.5、1、2、6、10、15、20μL,分别进样分析。以进样量对峰面积积分值进行回归处理,得阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯的回归方程,结果表明各化学成分在相应浓度范围内线性关系良好,见表2。分别精密吸取混合对照品溶液各0.5,1,2,6,10,15,20μL,进样,以阿魏酸为内标,计算洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯的校正因子,见表32.3.3加样回收试验分别取川芎饮片(批号20120508,No.3)和当归(批号20120410,No.10)饮片的粉末,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,连续进样6次,测定,以相应色谱峰的峰面积计算RSD,结果川芎饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯的RSD(n=6)分别为0.15%、0.12%、0.43%、0.17%;当归饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯的RSD(n=6)分别为0.80%、0.36%、0.28%。表明该方法精密度良好。2.3.4加样测定分别取同一批次川芎饮片(批号20120508,No.3)和当归(批号20120410,No.10)饮片的粉末,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各6份,进样测定。结果川芎饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯平均含量(n=6)分别为2.234、1.696、11.342、11.427mg·g-1,RSD分别为0.33%、0.10%、0.77%、0.37%;当归饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯平均含量(n=6)分别为0.746、0.244、3.850mg·g-1,RSD分别为0.97%、0.87%、0.70%。表明该方法重复性良好。2.3.5年生中国饮料分别取同一批次川芎饮片(批号20120508,No.3)和当归(批号20120410,No.10)饮片的粉末,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,分别在0、1、3、6、12、24h进样,川芎饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯峰面积的RSD(n=6)分别为0.69%、0.76%、0.11%、0.33%;当归饮片中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯峰面积的RSD(n=6)分别为1.5%、0.83%、0.43%,结果表明川芎、当归的供试品溶液在24h内稳定。2.3.6对照品溶液的制备取已知含量的川芎饮片(批号20120508,No.3)和当归(批号20120410,No.10)饮片的粉末均为0.1g各6份,精密称定。川芎饮片中分别精密加入阿魏酸对照品溶液(0.2223mg·mL-1)1mL、洋川芎内酯Ⅰ对照品溶液(0.1690mg·mL-1)1mL、洋川芎内酯A对照品溶液(0.3845mg·mL-1)3mL、藁本内酯对照品溶液(0.2431mg·mL-1)5mL;当归饮片中分别精密加入阿魏酸对照品溶液(0.0762mg·mL-1)1mL、洋川芎内酯Ⅰ对照品溶液(0.0241mg·mL-1)1mL和藁