内质网应激介导的细胞凋亡信号转导途径及关键酶的研究进展

内质网应激介导的细胞凋亡信号转导途径及关键酶的研究进展

细胞死亡，也称为细胞坏死，通常存在于各种组织中。内质网应激(ERstress,ERS)启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。它通过激活未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)以保护由ERS所引起的细胞损伤,恢复细胞功能,但是如果损伤太过严重,内环境稳定不能及时恢复,ERS则引起细胞凋亡,因此内质网应激与很多因素所致疾病的发生、发展密切相关,常见有神经系统变性疾病、糖尿病和病毒感染性疾病以及一些化学毒物中毒引起的疾病。在凋亡程序的启动及执行过程中,Caspases蛋白酶家族,C/EBPhomologousprotein(CHOP),Bcl-2家族以及凋亡信号调节激酶(ASK1)/C-Jun氨苯末端激酶(JNK)是目前证明细胞凋亡过程中起主要作用的生物大分子。以这些生物大分子作为靶点进行药物研究将为上述疾病的治疗开辟新的途径。笔者将重点介绍这4条信号转导途径以及相关药物的研究情况。1perk、atf6、ire-1信号通路诱导细胞凋亡内质网应激引起内质网功能紊乱,包括内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的堆积等,其中由蛋白质堆积所引起的一系列后续反应称为未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)。UPR是由1个内质网分子伴侣GRP78/BIP(glucose-regulatedprotein78/bindingimmunoglobulinprotein)和3个ER应激感受蛋白所介导的,分别是PERK(PKR-likeERkinase),ATF6(activatingtranscriptionfactor6)和IRE-1(inositol-requiringenzyme1)。无ERS时,PERK、ATF6、IRE-1分别与分子伴侣GRP78/BIP结合处于无活性状态;ERS时,未折叠蛋白在内质网内堆积使GRP78/BIP从3种跨膜蛋白上解离,转而去结合未折叠蛋白。解离后的感受蛋白被活化并启动UPR,降低未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的积累,恢复内质网的正常功能,是一个促生存响应。PERK、ATF6以及IRE-1信号不仅能够启动ERS的生存途径,严重或长时间的ERS损伤ER的功能时,这3个信号通路同样能够启动由ERS所介导的凋亡信号通路,诱导细胞凋亡,以去除受损伤的细胞。然而它们并不是直接引起细胞凋亡的,而是通过激活下游的凋亡信号分子,如CHOP/GADD153、JNK、Caspase以及Bcl-2家族等。1.1caspase-12与ers诱导凋亡Caspase-12定位于ER外膜,是介导ERS凋亡的关键分子,在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可发生凋亡。表明Caspase-12与ERS介导凋亡机制有关,而与非ERS介导的凋亡无关。正常生理情况下,Caspase-12与其他的caspases一样以无活性的酶原形式存在。Caspase-12酶原激活特异地由内质网损伤引起,重组Caspase-12切割并激活Caspase-9酶原,活性Caspase-12需与另外内质网应激分子协同作用使Caspase-9激活,活化的Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效应Caspase,效应Caspase切割多ADP聚合酶(PAfuP)和多种其他细胞内的底物,最终导致细胞凋亡。1.2网应激特异性的转录因子GADD153/CHOP(growtharrestandDNA-damage-induciblegene153或C/EBP-homologousprotein)是内质网应激特异的转录因子,属C/EBP转录因子家族成员。CHOP(C/EBPhomologusprotein)基因也参与内质网应激反应诱导细胞凋亡。正常情况下,CHOP表达十分低,在内质网应激反应时,其表达显著增加。ERS反应时,跨膜蛋白IRE1和ATF6活化,其胞浆部份进入核内,与ERSE(ERstressresponseelement)保守基序CCAAT(N9)GCACG中的GCACG相连,CCAAT被NF-Y(CCAAT-bingingfactor)占据,启动CHOP转录与表达,从而诱导细胞凋亡。1.3抗凋亡蛋白bcl-2家族对ers引起细胞凋亡的活性Bcl-2家族在ERS反应性凋亡中的作用目前已有报道。Bcl-2家族成员不仅存在于线粒体上,而且也定位于内质网膜上并影响ER的稳态。Bcl-2/Bcl-xl能够抑制ERS引起的细胞凋亡,Bax和Bak的缺失都可以保护由ERS引起的细胞凋亡,表明Bcl-2家族参与了ERS诱导的细胞凋亡。非应激时,位于内质网膜上的促凋亡蛋白Bax和Bak与抗凋亡蛋白Bcl-2结合而处于无活性状态。ER应激激活CHOP蛋白和JNK激酶,二者均可以削弱Bcl-2的抗凋亡功能,从而诱导ER膜上Bax和Bak构象变化并寡聚化最终导致ER膜完整性的破坏、内钙外流,细胞质内Ca2+浓度的升高最终可诱发细胞凋亡。1.4ire-1和traf2-ask1的激活IRE-1介导的XBP1(X-boxbindingprotein-1)的剪接诱导的UPR能够促进细胞的生存,IRE-1的过表达会促进HEK193(人胚肾细胞)的凋亡。激活的IRE-1,其胞浆的酶结构域招募接头分子TRAF2(TNF-receptor-associatedfactor2),并与ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASK1复合物,既而激活JNK。过表达ASK1会诱导细胞的凋亡,而在ASK1–/–细胞中,ERS则不能诱导JNK的激活以及细胞凋亡,表明ASK1是ERS诱导JNK的激活以及细胞凋亡所必需的。2亡相关肿瘤、自身免疫疾病细胞凋亡的失衡将导致许多疾病的发生,如神经退行性疾病与神经细胞过度凋亡相关,而肿瘤、自身免疫性疾病则与凋亡减弱相关。由上述可知,Caspases,CHOP等在细胞凋亡机制中发挥了重要的作用,因此针对它们来进行凋亡保护或促进凋亡以寻找新靶点药物治疗疾病具有重要的理论和实际意义。2.1camp葵抑制剂2.1.1对细胞凋亡的抑制抑制剂细胞因子效应调节剂A(cytokineresponsemodifierA,CrmA):CrmA是第一个被证实的天然的Caspases抑制剂(Mr38×103),当它被水解时,裂解产物紧密结合在丝氨酸蛋白酶的活性部位上,使酶失活。通过体外实验证明,它能抑制Caspase-1和Caspase-8(活性抑制常数分别为Ki=10pmol·L-1和Ki<300pmol·L-1),而对Caspase-3的活性较弱(Ki>100nmol·L-1)。已从哺乳动物中找到CrmA类似物PI9。它通过与Caspase-8和Caspase-10的中间产物的活性形式相互作用而发挥对细胞凋亡的抑制作用。有研究表明,转染CrmA能够有效地抑制由Caspase28介导的心肌细胞凋亡,从而提高心肌细胞对缺氧的耐受能力。p35蛋白是杆状病毒产生的一种(Mr35×103)。它能阻止被感染的细胞进入凋亡。它抑制Caspase活性的作用机制与P1位点被Caspase水解后导致亚单位与Caspase形成稳定的复合体有关。它能抑制哺乳动物细胞的Caspase-1,-3,-6,-7,-8和-10的活性。有研究发现,转染p35基因可以阻止果蝇胚胎发育过程中的细胞凋亡;在小鼠中,p35的表达使胸腺细胞能够对几种凋亡诱导剂的刺激产生抵抗作用。凋亡抑制蛋白(IAPs):IAPs是惟一内源性的Caspases效应酶抑制剂。主要通过抑制Caspase某些成员的活性而抑制凋亡,它们能直接抑制Caspase-3,-7和-9的活化形式以及Caspase-9的前体。目前至少发现了7种人类的IAPs:NAIP、c-IAPI(HIAP2)、c-lAF2(HP1)、XlAP(hILP)、BRUCE、Sur-vivin和Livin(ML-IAP)等。Survivin和Livin能与Caspase-3和-7直接结合并抑制其活性,Livin还能抑制Caspase-9的活性。Survivin和Livin在正常细胞中不表达或低表达,但是在胚胎及肿瘤细胞中则异常表达,提示抑制其表达将有可能成为肿瘤治疗的新策略。2.1.2caspases抑制剂抑制剂肽类模拟物抑制剂:二肽广谱Caspases抑制剂MX1013,在脑缺血、Fas介入的肝损伤和急性心肌梗塞的凋亡动物模型中都显示了明显的效果,而且对非Caspases的蛋白酶的活性都比较差,在很多细胞模型中,0.5μmol·L-1剂量下就能抑制凋亡。IDN-6556(3-{2-[(2-tert-butyl-phenylaminooxalyl)-amino]-propionylamino}-4-oxo-5-(2,3,5,6-tetrafluoro-phenoxy)-pentanoicacid)是广谱性的不可逆的Caspases抑制剂,它对Caspase-1,-3,-6,-8的抑制活性都较强。实验证实,肝损伤的啮鼠动物在给予3g·L-1的IDN-6556后能够显著降低丙氨酸转氨酶(ALT),细胞凋亡和Caspase的活力。Anilinoquinazolines(AQZs)是一个小分子Caspase-3抑制剂。AQZs抑制人类Caspas-3的Ki值在90~800nmol·L-1内。异喹啉-1,3,4-三碘甲状腺氨酸衍生物是一类新型的Caspase-3抑制剂,能够在1mg·kg-1的低剂量下显著减轻大鼠大脑中动脉暂时性栓塞所致的神经损伤,这说明此类化合物具有潜在的抗脑缺血作用。2.2内质网应激诱导剂多柔比星能够显著降低由毒胡萝卜素引起的凋亡。实验中应用毒胡萝卜素(一种内质网应激诱导剂,能够引起未折叠蛋白反应)和多柔比星来诱发人乳栗细胞MCF7的凋亡。结果证实,多柔比星能够显著降低毒胡萝卜素诱导的凋亡,并发现多柔比星发挥作用伴随有UPR-特异的凋亡前体蛋白CHOP的表达减少。2.3氨基酸诱导的dr5表达及肺癌发展二吲哚基甲烷及其衍生物通过内质网应激依赖的DR5增量调节,提高CHOP的表达,诱导了胰腺癌细胞的凋亡。法呢酰基转移酶抑制剂lonafarnib诱导了CHOP依赖的DR5的表达,从而导致了人类癌细胞的凋亡。Cephalostatin1增加了CHOP的表达,CHOP的过表达导致了细胞周期的停滞和凋亡。从而为抗癌提供新思路。同时,Cephalostatin1还能激活ASK1/JNK信号转导途径,并能在内质网应激中激活Caspase-12。2.4蛋白酶体抑制剂5,7-dihydroxy-8-nitrochrysin(NOChR)通过激活PPARγ和降低Bcl-2/Bax的比率来诱导人类胃癌SGC-7901细胞系的凋亡。Bortezomib(Velcade,PS341)是一种蛋白酶体抑制剂。它在20S的核内通过与糜蛋白酶相似位点可逆的结合来抑制蛋白酶体。它是第一个应用于多发性骨髓瘤和实体瘤的临床实验中的蛋白酶体抑制剂。在MCL(外套细胞淋巴瘤,是一种成熟的B-细胞淋巴瘤)中加入bortezomib后会导致磷脂酰丝氨酸的暴露,线粒体去极化,ROS的增殖,Bax和Bak的构像改变,Caspase的激活等,从而诱导淋巴瘤细胞的凋亡。2.5保护6-羟基多肽的作用最近研究显示,MLK3(mixed-lineageKinase3)和ASK1(apoptosis-inducingKinase1)都与缺血诱导的神经细胞死亡有关。该细胞死亡是由MLK3/JNK3和ASK1/JNK信号途径介导的。K252a原本只是Trk(酪氨酸激酶原癌基因)的抑制剂,新近研究发现,K252a能够通过抑制MLK3/JNK和ASK1/JNK3的级联放大来保护6-羟基多巴胺损伤。此外,K252a还能经由JNK的核途径和非核途径,降低6-羟基多巴胺毒素介导的对多巴胺能细胞体和突触的损伤。因此在帕金森病的治疗中,K252a可能具有重要的神经保护作用。亚硒酸盐是一种基本的生物微量元素,已经证实对与信号转导有关的调节蛋白有调整功能,并且能够影响细胞的生长,生存和死亡。在大鼠海马脑缺血早期再灌注模型中,亚硒酸盐能够通过激活抗凋亡PI3K/AKT途径来显著抑制ASK1/JNK级联反应的激活。这给我们提供了一个新的暗示,抗氧化剂可能通过激活PI3K/AKT途径,抑制ASK1/JNK级联放大反应来降低氧化应激诱导的局部缺血性脑损伤。亚硒酸盐还能够通过上调Bcl-2的表达,线粒体膜电位,ATP增殖来增加细胞增殖。亚硒酸盐还能够阻断过氧化氢诱导的凋亡,这与阻断ASK1有关。亚硒酸盐还能阻断Caspase-9和-3的活化。这些观察结果阐明了亚硒酸盐是通过激活抗凋亡信号来增加细胞增殖的。3