高效液相色谱法测定五味子种子中6个木脂素类成分

高效液相色谱法测定五味子种子中6个木脂素类成分

中药的多成分决定了多指标质量评价的模型。指纹图谱能较全面体现中药成分的整体性,是目前符合中药特点的质量控制模式之一。一测多评法(QAMS)是指以样品中某一典型组分为内标,建立该组分与其他组分之间的相对校正因子(RCF),通过RCF计算其他组分的含量,适用于对照品难得或制备成本高或不稳定的情况下同类多成分的同时测定。指纹图谱和一测多评相结合可以相互取长补短,为更全面合理科学地评价中药质量提供技术支撑。五味子习称“北五味子”,为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。现代研究表明,五味子具有保肝、抗氧化等药理作用,木脂素类成分为其最主要的活性成分。本课题组先期研究发现,五味子中的木脂素类成分85%以上存在于种子中(另文发表)。本研究采用指纹图谱和一测多评相结合的方法,在建立五味子种子指纹图谱的基础上,建立了QAMS法同时测定五味子种子中6种木脂素类成分含量的方法。1药物、试剂与材料WatersAlliance高效液相色谱系统,包括e2695分离单元、2998二极管阵列检测器、Empower色谱工作站(美国Waters公司);ShimadzuLC-2010CHT高效液相色谱仪,包括LC-2010CHT溶液传输单元、SIL-20A自动进样器、紫外检测器、LabSolutions色谱工作站(日本岛津公司);SartoriusBT25S型电子天平(德国赛多利斯公司)。五味子醇甲(批号:110857-201211)、五味子酯甲(批号:111529-200604)、五味子甲素(批号:110764-201111)、五味子乙素(批号:1100765-200710)对照品购自中国食品药品检定研究院,五味子醇乙(批号:20120517)、五味子丙素(批号:20120517)对照品购自鼎瑞化工(上海)有限公司。乙腈、甲醇均为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。五味子药材(批号:130623)购自南通三越中药饮片公司,加水(用水量刚好浸过药材表面即可)浸泡5h,搓去果肉,种子45℃干燥24h后粉碎,过40目筛,得1号样品;其余10批为醋五味子,购自江苏省内10家医院中药房,同法处理,得2~11号样品。经南通市药品检验所龚旭东主任中药师鉴定,以上药材的植物来源均为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.。2方法和结果2.1指纹谱的构建2.1.1u3000定期密度条LichrosphereC18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~10min,20%~60%A;10~30min,60%A;30~40min,60%~75%A;40~50min,75%~80%A);流速1.0mL/min;柱温30℃;检测波长217nm。2.1.2混合对照品溶液精密称取五味子醇甲4.50mg、五味子乙素2.66mg,分别置10mL量瓶中,五味子醇乙2.04mg、五味子酯甲1.04mg、五味子甲素1.21mg、五味子丙素1.29mg,分别置5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,配成6个对照品储备液。精密吸取五味子醇甲、五味子乙素对照品储备液各1mL,五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素对照品储备液各0.5mL,置5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,配成混合对照品溶液。将上述对照品储备液、混合对照品溶液于4℃保存,备用。2.1.3提取方法提取率取样品约1g,精密称定,置50mL圆底烧瓶中,加5mL95%乙醇,浸泡30min,回流提取3次,每次1h,合并提取液,放冷,4000r/mim离心10min,上清液移置20mL量瓶中,加95%乙醇至刻度,摇匀,取1.7mL置10mL量瓶中,加95%乙醇至刻度,摇匀,即得。进样前用0.45μm微孔滤膜滤过。2.1.4仪器精密度试验精密吸取1号样品供试品溶液10μL连续进样6次,记录指纹图谱,24个共有色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD分别小于0.22%和6.21%,表明仪器精密度良好。2.1.5指纹图谱测定精密吸取1号样品供试品溶液10μL,分别于制备后的0、3、6、9、12和24h进样测定,记录指纹图谱,24个共有色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD分别小于0.22%和6.34%,表明供试品溶液在24h内稳定。2.1.6重复性试验取1号样品各约1g,精密称定,按“2.1.3”项下方法制备6份供试品溶液,进样测定,记录指纹图谱,24个共有色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD分别小于0.18%和6.42%,表明样品处理方法的重复性较好。2.1.7指纹图谱共有模式的建立分别精密吸取11批样品供试品溶液10μL进样测定,将11批样品的指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A版),生成指纹图谱共有模式,其中共有峰24个。精密吸取混合对照品溶液10μL进样测定,通过与对照品保留时间比对,指认了五味子对照指纹图谱24个共有峰中的6个,分别为2号峰(五味子醇甲)、5号峰(五味子醇乙)、11号峰(五味子酯甲)、16号峰(五味子甲素)、21号峰(五味子乙素)、23号峰(五味子丙素)。选择2号峰五味子醇甲为参照峰(S),以该参照峰计算相对保留时间和峰面积比值进行方法学考察。见图1、2。2.1.8指纹图谱的相似度以共有模式作为对照指纹图谱,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A版)对11批样品指纹图谱进行相似度评价,结果表明相似度均大于0.980。见表1。2.2采用1-评价法测定了六种木脂素的含量2.2.1线性范围的测定分别精密吸取混合对照品溶液1、3、6、9、12、15、18μL,进样测定,以峰面积Y对进样量X(μg)进行回归处理,得5种成分的回归方程及线性范围。见表2。2.2.2加样回收率和rsd取1号样品各约0.5g6份,精密称定,分别精密加入一定量对照品,按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液,进样测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的平均回收率分别为97.07%、96.99%、98.24%、97.33%、96.76%和96.50%,RSD分别为3.55%、3.19%、2.27%、3.61%、2.70%和2.84%。见表3。2.2.3rcf的计算RCF计算公式:fs/i=(Ws×Ai)/(Wi×As),其中,As为内参物峰面积,Ws为内参物质量,Ai为某待测组分i峰面积,Wi为某待测组分i质量。根据RCF计算公式可得(Ws×Ai)/As=fs/i×Wi,以Wi对(Ws×Ai)/As作回归处理,所得回归曲线的斜率即为RCF。以五味子醇甲为内参物(A),取线性关系考察项下6个质量点测得的数据计算得待组分五味子醇乙(B)、五味子酯甲(C)、五味子甲素(D)、五味子乙素(E)和五味子丙素(F)与内参物的相对校正因子fA/B、fA/C、fA/D、fA/E和fA/F分别为0.8136、0.7934、0.9548、0.9483和0.6647。2.2.4色谱柱对校正因子的影响精密吸取混合对照品溶液10μL,进样分析,在两个实验室分别考察了Waters、Shimadzu两种高效液相色谱系统和SymmetryC18(250mm×4.6mm,5μm)、LichrosphereC18(250mm×4.6mm,5μm)两种色谱柱对相对校正因子的影响,结果RSD均小于5%,表明在不同实验室、不同色谱系统和不同色谱柱下具有良好的重现性。见表4。2.2.5色谱条件对重现性的影响本研究考察了相对保留值(ri/s=tRi/tRs)和保留时间差(Δti/s=tRitRs)两种参数在两种高效液相色谱仪和两种不同型号色谱柱中的重现性,结果表明各待测成分相对保留值RSD均小于5%,可以用于待测成分色谱峰的定位,而保留时间差均大于10%,不宜采用。通过该法预测出峰时间后,若该色谱峰临近还有其他色谱峰,再根据紫外吸收光谱、整体峰形或峰面积百分比,能够在一定程度上准确定位色谱峰。见表5。2.2.6药代动力学测定结果分别精密吸取1~11号样品供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪测定。采用外标法测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的含量,再用建立的QAMS法进行含量计算,并以相对误差为参数对两种方法所得结果进行比较,结果表明,相对误差均小于3%,提示建立的方法具有较好的可信度。见表6。3流动相系统分离效果的测定3.1本课题组前期以回流次数、时间、乙醇浓度及用量4个因素,每个因素设3个水平,采用正交试验法优选了五味子种子种木脂素