基于复杂网络的银杏叶治疗心脑血管类疾病的网络药理学研究

基于复杂网络的银杏叶治疗心脑血管类疾病的网络药理学研究

网络药理学是在高通量组学数据分析、计算机建模和网络数据库搜索的基础上，为生物网络的构建和分析而开发和分析药物作用机制的研究和发现创新药物。网络药理学从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发,采用复杂网络模型表达和分析研究对象的药理学性质,特别适宜研究中药多成分-多靶点的作用关系,有利于揭示中药成分复杂作用机制。网络药理学概念自2007年被提出以来,国内外已有不少相关的研究报道,如范骁辉等采用网络药理学方法研究复方丹参方,网络分析表明9个活性成分均作用于多个靶点,呈现出方剂多成分、多靶点、整合调节作用特点;乔延江等采用网络药理学方法研究活血化瘀中药,通过网络对比计算,筛选得到中药与西药治疗冠心病138个相同作用节点和397个中药独特作用节点,表明中药治疗冠心病确实存在有别于西药的独特作用机制;王毅等以中药附子的22个化学成分预测出多个作用靶点,所建网络模型中每个化合物的平均靶点数为16.3,平均每个靶点与4.77个化合物相关联,反映出中药“多成分、多靶点”的特点。银杏叶为银杏科银杏属植物银杏(GinkgobilobaL.)的树叶。银杏叶提取物(GBE)是从银杏叶中分离纯化的提取物,具有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子、降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态等作用,因而在临床上被广泛用于预防和治疗心脑血管类疾病。但是,其药效成分及关键作用靶点尚待系统研究和揭示。本文以银杏叶为研究对象,利用随机森林算法建立药物分子-靶点相互作用预测模型,对银杏叶化学成分进行靶点预测,然后构建银杏叶“成分-靶点-心脑血管相关疾病”复杂网络,从网络药理学角度预测银杏叶治疗心脑血管类疾病的有效成分及其潜在靶点,为开发更好的心脑血管类候选药物提供参考依据。1方法1.1阳性样本集集从KEGG数据库下载小分子化学药的分子结构及其相应靶蛋白受体,剔除缺乏实验数据的药物-靶点,最终获得4782条药物-靶点配对,其中包括2711条药物-酶蛋白受体、1365条药物-离子通道蛋白受体、620条药物-G蛋白受体、86条药物-核蛋白受体。以上数据作为本研究的阳性样本集。阴性样本集:将阳性样本集中的药物-靶点配对拆开,各类分别进行重新组合配对,剔除已包含在阳性样本集中的配对结果,最后随机挑选出两倍于阳性样本集的配对结果,即生成阴性样本集。训练集:分别合并上述4类药靶配对阴阳样本,即得训练集数据。1.2一般概念的表达其中x0(i)是原始数据;x(i)是归一化后数据,其值在-1到1之间。1.3随机森林的构建随机森林(RandomForest,RF)是LeoBreiman于2001年提出的一个组合分类器算法,它是利用bootsrap重抽样方法从原始样本中抽取多个样本,对每个bootsrap样本进行决策树建模,然后组合多棵决策树的预测,通过投票得出最终预测结果。在树的每个节点处,从M个特征中随机挑选mtry个特征(mtry<<M),通常假设。按照节点不纯度最小的原则,从这mtry个特征中选出一个特征进行分支生长。单棵分类树进行充分生长,使每个节点的不纯度达到最小,不进行通常的剪枝操作。将生成的ntree棵分类树组成随机森林,用随机森林分类器对新的数据进行判别与分类,分类结果按树分类器的投票多少而定,即:在上述随机森林构建过程中,生成每棵分类树时所应用的自助样本集从原始数据中随机选取,每个节点处所采用的变量也是从所有变量中随机选取。此2次随机过程使得随机森林具有较大的稳定性和较优的性能,能在较好地容忍噪声的同时提高分类精确度。RF作为一种优秀的数据挖掘算法,目前已被广泛运用于生物、医药、物理、化学等领域。2结果与讨论2.1k折交叉验证应用随机森林法建立模型,需要优化其主要参数,即树数(ntree)和每棵树的节点数(mtry)。本文采用网格搜索法进行参数优化,以获得最高的K折交叉验证(K-foldcross-validation)正确率。所谓K折交叉验证,即将初始采样分割成K个子样本,一个单独的子样本被保留作为验证模型的数据,其他K-1个样本用来训练。交叉验证重复K次,每个子样本验证一次,平均K次的结果或者使用其他结合方式,最终得到一个单一估测。本研究中K=10,正确率(accuracy)见公式(3)定义,优化结果列于表1。其中NY代表分类错误的样本个数,Y代表所有样本个数。2.2中药-靶点-疾病网络模型构建将上述34个化合物与四种已知的靶点进行组合,构建预测集。预测集按训练集相应的方法计算分子描述符、降维和归一化等处理,然后代入RF模型进行靶点预测。表2列出了与银杏叶化学成分作用频次较高的前15个靶点,提示它们可能是银杏叶治疗心脑血管类疾病的关键靶标;进一步地,应用Cytoscape软件构建银杏叶成分-靶点-疾病网络模型,见图1。网络中黄色三角形节点表示银杏叶化学成分;红色圆形节点表示靶点;绿色正方形节点表示心脑血管相关疾病;若某一靶点为某化合物的潜在作用靶点,则以边相连。从图1可见,银杏叶所含34个成分与靶点存在复杂的网络关系,网络模型中平均相邻节点数目为10.517,反映出中药多成分-多靶点-多疾病相关的特点。同时可见5号化合物(山奈酚)、20号化合物(白果苦内酯A)、31号化合物(异鼠李素)、40号化合物(表儿茶素)、50号化合物(银杏内酯A)、52号化合物(银杏酮)、62号化合物(白果苦内酯B)、63号化合物(白果苦内酯C)、64号化合物(白果苦内酯J)、65号化合物(白果苦内酯M)等成分在网络中连接度较高(见表3),提示其可能是银杏叶发挥药效的重要成分。2.3在文献中对计算得到的银杏叶与心脑血管疾病相关的潜在作用靶点进行了文献验证,发现预测出的四类受体相应靶点均有相关文献报道。2.3.1法律及其他浸提液对cyp2c9类内基类化合物3a4的诱导作用潜在作用靶点主要是CYP酶、PDE酶、ACE酶、COX酶等。目前国内外关于GBE对细胞色素CYP酶的影响没有得到一致的结果。一项以人P450微粒体为研究对象的试验中,荧光法测定GBE及其黄酮类成分和萜类内酯成分对CYP450的活性影响,发现GBE能抑制CYP2C9,CYP1A2,CYP2E1和CYP3A4的表达,黄酮类成分能抑制CYP2C9,CYP1A2,CYP2E1和CYP3A4的表达,萜类内酯成分只显著抑制CYP2C9的表达。SugiyamaT等采用小鼠研究GBE对甲苯璜丁脲降血糖作用的影响,实验提示长期服用GBE,诱导了小鼠的CYP2C9;而单独一次服用GBE,可能抑制CYP2C9的活性。人体临床试验关于GBE对CYP2C9的影响并没有得到与上述一致的结果。YinOQ等研究提示,健康志愿者长期服用GBE可能对CYP2C19活性具有诱导作用,并且GBE对CYP2C19的诱导作用具有基因型依赖性。谭萍等研究发现,GBE可使急性脑梗死患者血小板PDE3活性进一步下降,加强PDE3在脑梗死急性期的保护作用,有效抑制血小板聚集,改善血液循环及神经功能缺损。耿秀芳等研究表明,银杏叶单黄酮山奈酚,槲皮素对ACE的抑制率分别是74%,53%。张爱林研究表明,复方银杏滴丸可以显著降低模型大鼠脑皮质COX-2mRNA表达,影响脑缺血后PAF-COX-2信号通路在神经元损伤中发挥作用。2.3.2不同低温状态下gbe干预的效果潜在作用靶点主要是GABA受体、CACN受体、KCN受体、SCN受体等。例如,王何等研究发现,脑缺血后,单纯亚低温干预及分别在常温或亚低温状态下给予GBE干预,均使Glu、MDA水平显著降低,GABA、SOD、GSH-Px水平显著上调,亚低温状态下GBE干预的效果更显著。张绪国等研究推断,GBE能明显缩短APD,抑制心肌细胞钙离子通道的开放,具有明显的浓度依赖关系,可能是其抗心律失常的分子基础。孙柯等研究发现,银杏内酯能够降低海马神经元钾离子通道的电流幅度,可影响钾离子通道的激活过程。2.3.3gbe对大鼠海马2肾上腺素受体的影响潜在作用靶点主要是ADR受体、5-HT受体等。已有报道,老年大鼠皮层和海马部位肾上腺素α2受体较年轻大鼠显著减少。长期给GBE后,肾上腺素α2受体显著增加,并使大鼠皮层区去甲肾上腺素的更新增加。Caltagirone通过对大鼠的实验,让大鼠持续服用GBE能够上调鼠海马α2肾上腺素受体,增加大脑皮质层去甲肾上腺素受体数目,而减少β肾上腺素受体的数目。黄九龙研究结果提示,银杏叶总黄酮抑制介导迟慢兴奋性后电位产生的5-HT的释放以及与突触后膜上相应的受体结合。2.3.4其他疾病的相关研究潜在作用靶点主要是ER受体。如OhSM等在GBE抗雌激素作用的研究中表明,GBE可作用于核蛋白受体ER。上述预测的靶点除与心脑血管类疾病相关外,其他一些重要相关疾病也得到了相关文献验证。如朱诗平等研究表明,银杏叶提取物片能降低肾间质纤维化大鼠的血清肌酐、尿素氮,减少24hMTP,具有肾功能保护作用,其机制可能与上调ACE2蛋白和mRNA表达水平而发挥抗肾间质纤维化的作用相关。周燕红等推测EGB可能通过下调促炎细胞因子(TNF-A,NF-κBp65,IL-6)来抑制COX