赤芍中2种化学成分的一测多评法研究

赤芍中2种化学成分的一测多评法研究

“一测多评价”法是一种用于控制多成分质量的研究方法，以解决中药质量控制中缺乏对照材料的问题。该方法已被《中华人民共和国药典》2010版一部收录,并成功应用于中药中同类型成分和不同类型成分的含量测定。赤药为常用中药,《中华人民共和国药典》2010年版规定赤芍为毛茛科植物芍药PaeoniaLactifloraPall.或川赤芍PaeoniaveitchiiLynch的干燥根,具有活血祛瘀,清热凉血之功效。以芍药苷为代表的单萜及其苷类成分是赤芍中公认的主要活性成分,目前对赤芍的质量控制主要是根据芍药苷含量高低进行评价。此外研究还发现没食子酸及其烷醇酯是赤芍中的主要成分类型,对血小板聚集有对抗作用,对心脑血管梗塞、短暂性局部脑缺血、过敏及哮喘等有治疗作用,与赤芍的临床功效密切相关,亦可作为其质量控制的指标之一。但因缺乏相应对照品,限制了同时对赤芍中这两类主要成分进行含量测定在实际工作中的应用。作者应用“一测多评”法对赤芍进行多指标质量控制,针对芍药苷类和没食子酸类两种不同类型化学成分开展一测多评研究。以价廉易得的芍药苷作为内参物,通过建立其与芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、没食子酸甲酯和五没食子酰基葡萄糖的相对校正因子进行含量计算,探讨一测多评法在实际工作中的应用范围。1实验仪器与试剂1100高效液相色谱仪(DiodeArrayDetector,美国Agilent公司),Watersalliance(e2695SeparationModule,e2998PhotodiodeArrayDetector,美国Waters公司),电子分析天平(MettlerAE200,瑞士Mettlertoledo公司),KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈、磷酸(色谱纯,美国Merck公司),水为MilliQ超纯水(Millipore,美国Bedford公司),甲醇、乙醇等分析纯试剂(上海国药集团化学试剂有限公司),芍药苷(paeoniflorin,PF)、芍药内酯苷(albiflorin,AF)、苯甲酰芍药苷(benzoylpaeoniflorin,BPF)、没食子酸(gallicacid,GA)、没食子酸甲酯(methylgallate,MG)和五没食子酰基葡萄糖(pentagalloylglucose,PG)等对照品均为自制,以HPLC检测,经面积归一化法计算在高、低浓度纯度质量分数均在98%以上。收集市售赤芍样品16批,由上海中医药大学吴立宏副研究员鉴定为毛茛科植物芍药PaeoniaveitchiiLynch的干燥根,标本保存在上海中医药大学。样品粉碎,过350μm筛,抽真空保存。2方法和结果2.1方法研究2.1.1流动相、流速、测定波长色谱柱:VarianPolarisC18-A(4.6mm×250mm,5μm)、UltimateAQ-C18(250mm×4.6mm,5μm)、AgilentXDB-C18(250mm×4.6mm,5μm)、Agelavenusil-MPC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)-体积分数为0.02%的磷酸水溶液,梯度洗脱(A/φ),0~8min:5%~9%,8~20min:9%~15%,20~25min:15%~17%,25~40min:17%,40~45min:17%~30%,45~60min:30%;流速:1.0mL·min-1;检测波长:230nm;柱温:30℃;进样量:10μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于5000。色谱图见图1。2.1.2没食子酸甲酯溶液的制备分别取芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、没食子酸甲酯和五没食子酰基葡萄糖适量,精密称定,加甲醇分别制成每1mL各含30、20、10、90、50、10μg的溶液,即得。2.1.3超声处理法取本品粉末(过350μm筛)约0.4g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入体积分数为80%的甲醇溶液50mL,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)30min,放冷,再称定质量,用体积分数为80%的甲醇溶液补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液即得。2.1.4混合对照品溶液的制备分别取芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸、没食子酸甲酯和五没食子酰基葡萄糖适量,精密称定,分别置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制得对照品贮备溶液。再分别精密吸取不同体积各对照品贮备溶液适量,置10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制得系列浓度的混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液10μL,按上述色谱条件测定,以对照品的质量浓度(ρ)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标,进行回归处理,得回归方程见表1。2.1.5仪器精密度试验精密吸取同一浓度的混合对照品溶液10μL连续进样6次,记录峰面积,没食子酸、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷峰面积的RSD分别为0.8%、1.7%、1.4%、1.9%、1.3%、1.4%,表明仪器精密度良好。2.1.6重复性试验结果取同一赤芍样品粉末6份,精密称定,按“2.1.3”条下操作,在上述色谱条件下进样测定,测得没食子酸、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷的平均含量分别为0.62%、0.11%、0.30%、3.67%、1.83%、0.13%,RSD分别为1.4%、2.5%、2.3%、1.7%、1.5%、2.6%,表明方法重复性良好。2.1.7稳定性试验取赤芍样品粉末约0.4g,精密称定,按“2.1.3”条下操作,分别在1、4、8、16、24、36h进样分析,记录峰面积,RSD值均小于3%,表明样品溶液在36h内稳定性良好。2.1.8加样回收率和rsd取已知含量的赤芍样品粉末9份,各约0.2g,精密称定,分别按已知含量的50%、100%、150%3个水平加入对照品,按“2.1.3”条下操作,在上述色谱条件下进样测定,计算加样回收率,没食子酸、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷的加样回收率分别为96.5%、98.2%、97.9%、98.1%、99.4%、100.8%,RSD分别为2.5%、1.6%、1.7%、2.8%、2.2%、3.1%。2.2多元化因子的筛选取绘制标准曲线的系列浓度对照品溶液,注入液相色谱仪,测定,以芍药苷为内参物,计算没食子酸、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷的校正因子(relativecorrectionfactor,RCF),结果见表2。2.3正常对照测定考察了WatersallianceHPLC和Agilent1100HPLC液相色谱系统,使用4根不同品牌和型号的色谱柱VarianPolarisC18-A(4.6mm×250mm,5μm),UltimateAQ-C18(4.6mm×250mm,5μm),AgilentXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm),Agelavenusil-MPC18(4.6mm×250mm,5μm),取混合对照品溶液,注入液相色谱仪,测定,以芍药苷为内参物,计算没食子酸、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、五没食子酰基葡萄糖和苯甲酰芍药苷的校正因子(RCF),结果见表3。2.4相对保留值的影响分别计算各待测组分与内参物芍药苷的相对保留值(r)和保留时间差(△tR)2种参数作为色谱峰定位标准,结果表明相对保留值波动较小,保留时间差波动较大,因此认为本实验中选用相对保留值作为目标色谱峰的定位指标比较合适,并考察了其在不同品牌仪器和不同规格色谱柱上的重复性,见表4。在“一测多评”法的实际应用中,可参考药材典型色谱图,利用相对保留值定位,根据内参物芍药苷的保留时间,通过相对保留值结合待测组分色谱峰的紫外吸收特征,能够正确判断目标峰的准确峰位置。2.5测定总糖含量测定取16批赤芍样品粉末约0.4g,精密称定,按“2.1.3”条下操作,制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液进样分析,测定。采用外标法和一测多评法计算赤芍中芍药苷和没食子酸、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、五没食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍药苷的含量,见表5。外标法实测的含量与一测多评法计算的含量经t检验比较,P>0.05,表明2种方法测得含量无显著性差异。a—Externalstandardmethod;b—QAMSmethod3检测波长的选择芍药苷类和没食子酸类化合物均在230、270nm处有最大吸收,分别在210、230、254、270、300nm处检测,色谱峰紫外吸收采集波长为190~400nm。结果表明,254、270、300nm处各色谱峰之间分离度好,但检测灵敏度低;210nm检测,峰数与230nm检测基本一致,但基线不稳定,不利准确积分;兼顾两类成分的吸收强度与基线的平稳程度,选择230nm作为检测波长。作者考察不同仪器和色谱柱对校正因子的影响,验证一测多评法在赤芍质量控制中的可行性和技术适应性。结果表明本实验条件下相对校正因子具有较好的重现性,一测多评含量测定结果与传统方法含量测定结果之间无显著性差异,说明在缺乏定量用对照品的情况下,