绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落结构的电泳分析

绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落结构的电泳分析

曲酒是中国黄酒的特点和精髓，也是中国古代的重要发明之一。酒曲为黄酒酿造提供了各种酶类,主要是淀粉酶和蛋白酶。黄酒生产用曲分为大曲(麦曲、麸曲和米曲等)和小曲(白药和黑药)两种,统称为糖化发酵剂。麦曲中的微生物主要包括各类丝状真菌、细菌和酵母菌,这些微生物在黄酒的发酵过程中发挥着重要作用。由于原料、制曲工艺的不同,不同种类的麦曲在微生物群落结构上会存在一定的差异,导致麦曲中形成的酶系组成不同,最终影响黄酒的品质。机制生麦曲是以小麦为原料,粉碎后拌曲,机器压块成型,经自然接种堆放而成的;熟麦曲是原料小麦粉碎后,蒸熟,接种米曲霉,通风培养而成。在绍兴黄酒的现代机械化生产工艺中,为了减少麦曲用量,提高酶活力,提高原料利用率,使用生麦曲的同时也常常添加一定比例的熟麦曲。本实验室前期已对绍兴黄酒机制麦曲中的真菌群落做过较为系统的研究。李旺军采用培养法结合免培养法发现成品麦曲中所包含的真菌主要是Absidiacorymbifera、Saccharomycescerevisiae、Rhizopusoryzae、Rhizomucorpusillus、Aspergillusoryzae、Candidatropicalis、Emericellanidulans、Clavisporalusitaniae、A.fumigatus、A.niger、R.microsporus、Pichiaguilliermondii和P.anomala。变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis)技术最初由Fisher和Lerman发明用来检测DNA的点突变。Muyzer将PCR-DGGE技术首次应用于微生物生态学的研究,并且证实该项技术在研究微生物多样性方面具有明显的优势。近年来,很多学者利用PCR-DGGE技术对不同样品进行了微生物多样性的分析,包括对土壤、活性污泥、大酱、饮用水、白酒大曲、糟醅、酒醅和肠道菌群等样品的研究,结果表明,该分子生物学技术在揭示微生物多样性、种群差异等方面具有一定的优越性。它不依赖于传统的培养过程,缩短了样品的分析时间,还可以显示样品中不可培养微生物的信息。截至目前,尚未见利用分子生态学技术研究黄酒麦曲中细菌群落结构的报道。本研究建立了利用分子生态学技术PCR-DGGE,分析绍兴黄酒麦曲中细菌群落结构的实验条件,并成功鉴定了机制生麦曲和熟麦曲中的细菌种类。研究结果将丰富对绍兴黄酒麦曲中细菌群落的认识,为进一步理解细菌在黄酒发酵中的作用奠定一定的基础。1材料和方法1.1菌株、仪器和检测设备机制生麦曲、熟麦曲样品绍兴某黄酒厂;PCR所用试剂大连宝生物工程有限公司;SYBRGreenⅠ北京优尼康生物科技有限公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺南京生兴生物技术有限公司。DCode通用突变检测系统、GelDocXR凝胶成像系统美国BIO-RAD公司;FRESCO17微型冷冻离心机赛默飞世尔科技公司;TC-25/HPCR基因扩增仪杭州博日科技有限公司等。1.2实验方法1.2.1从麦曲样本中提取微生物总dna1.2.216srdna的pcr扩增1.2.2.srrna片段的扩增用通用引物27F、1490R进行16SrDNA片段的扩增,F341-GC、R518进行16SrDNAV3区片段的扩增。引物序列如下:1.2.2.pcrpcr-pcrdntp、rtaq酶5u/l25μL反应体系:10×buffer2.5μL,dNTP2.0μL,引物各1.0μL,模板0.5μL,rTaq酶(5U/μL)0.5μL,无菌双蒸水补足25μL。1.2.2.pcr反应程序采用嵌套PCR的方法,即第一步先扩增16SrDNA全长,第二步以16SrDNA全长为模板扩增16SrDNAV3区。第一步PCR反应程序:95℃预变性5min,95℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min30s,30个循环,最后72℃延伸10min。第二步PCR反应程序:94℃预变性4min,94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸45s,30个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.316srdnav3级硬化板层电泳dgge1.2.3.聚丙烯酰胺凝胶的电泳利用垂直电泳确定DGGE分析时的变性剂梯度范围。使用梯度混合器,配制变性剂梯度范围为20%~80%(100%的变性剂浓度为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶,凝胶浓度为8%。电泳条件:电泳温度60℃,电压150V,电泳时间4h。电泳结束后用SYBRGreenⅠ染色45min,染色结束后用凝胶成像系统进行拍照。1.2.3.电泳温度和时间范围使用梯度混合器,配制已经优化好的聚丙烯酰胺凝胶的变性剂梯度范围,凝胶浓度为8%。电泳温度60℃,电压150V,电泳过程中,以一定的时间间隔进行上样。电泳结束后用SYBRGreenⅠ染色45min,染色结束后用凝胶成像系统进行拍照。1.2.4pcr扩增ssr用无菌小刀将DGGE凝胶上的优势条带割下后,放到无菌离心管中,加入100μL无菌水,4℃过夜。取其上清液作为模板,用不带GC夹的引物F341、R518进行扩增,PCR扩增程序同上。把重新扩增好的PCR产物连接到pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,涂布到含有氨苄青霉素的LB培养基上培养。挑选阳性克隆子,按照上面的程序和条件扩增,再次进行DGGE电泳验证,与原割胶条带对应的阳性克隆子即为正确的克隆子。1.2.5检出限公司测序结果在genba将割胶条带比对正确的阳性单克隆送上海生工生物工程有限公司测序,获得的测序结果在GenBank数据库(/Blast.cgi)进行相似性检索。2结果与分析2.1变性剂浓度对dna片段迁移速度的影响通过垂直电泳能够确定适宜的变性剂梯度范围。DGGE垂直电泳即为电泳方向和变性剂梯度方向垂直,凝胶中变性剂的浓度从左到右逐渐增大,加样孔是一个占整个凝胶宽度的大孔(与梯度方向平行)。在变性剂低浓度边,DNA片段以双链形式沿着电泳方向迁移,迁移速度较快。在变性剂高浓度时,DNA片段发生部分解链,沿着电泳方向迁移时,速度较慢。在凝胶的中间区域,变性剂浓度接近DNA片段的解链温度,此时DNA片段部分解链,迁移速率急剧变化,故图谱中会出现“S”形曲线。分析图1和图2可得出,机制生麦曲和熟麦曲的变性剂梯度范围为50%~65%和40%~60%较佳。图1中横贯于“S”形曲线陡峭部分的亮线可能是PCR扩增时产生的单链DNA。2.2电泳时间的影响时间间歇(Time-travel)法,即每隔一定的时间进行一次上样,使样品的电泳时间呈现一定的梯度,用以在电泳结束后根据最终的电泳图谱确定最佳的电泳时间。电泳时间较短时,条带未完全分离,影响图谱的分辨效果。电泳时间延长的同时条带数目也逐渐增加。但电泳时间较长时,会有部分条带跑出凝胶,甚至条带弥散及DGGE凝胶中的变性剂梯度发生改变。分析图3和图4可以确定机制生麦曲的电泳时间为5~5.5h,熟麦曲的电泳时间为4.5~5h较佳。2.3不同麦曲中细菌群落的组成根据上述摸索建立的较佳电泳条件:机制生麦曲的变性剂梯度范围为50%~65%,电泳时间为5~5.5h;熟麦曲的变性剂梯度范围为40%~60%,电泳时间为4.5~5h,对两种麦曲样品进行DGGE分析,获得的电泳图谱如图5和图6所示。电泳图谱中不同位置的条带代表了不同种属的细菌;条带的荧光强度反映了该种细菌的丰度,条带越亮,表明该种细菌的相对含量可能越大。图谱中机制生麦曲的条带数量明显多于熟麦曲的条带数目,说明机制生麦曲中的细菌种类多于熟麦曲中的细菌种类。为明确绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落的种属组成,DGGE电泳结束后,进一步对各自的主要优势条带进行了切胶回收、T-A克隆、DNA测序及相似性检索。测序结果经GenBank数据库比对后,相似率均大于98%,比对结果显示两种麦曲中均存在糖多孢菌属及肠杆菌属的细菌。糖多孢菌属的许多菌种可以产生重要的生物活性物质,如各种酶类、抗生素、维生素等,如MasahiroNakao等就从一株糖多孢菌(Saccharopolysporarectivirgula)中分离纯化到了耐热半乳糖苷酶。该属细菌在黄酒发酵过程中的具体作用还有待进一步研究。同时还检测到了一株致病性病菌Clavibactermichiganensis,该病菌对黄酒生产造成的潜在危害需要进一步的评价。机制生麦曲电泳图谱中位于不同位置的条带E和H的最相似菌株相同,原因可能是16SrDNA多拷贝序列的不均一性。2.4系统发育树的建设用软件MEGA5对测序结果和GenBank中相关种属代表菌株的16SrDNA序列构建系统进化树,结果如图7所示。3pcr-dage分析DGGE电泳条件的选择在整个实验的分析过程中起着非常重要的作用,电泳条件的优劣直接关系到样品条带分离的好坏,继而影响后续的分析工作。在实际的实验过程中,仅靠设备说明书和一些参考文献,不易掌握实验细节,实验者需根据自己的样品优化自己的电泳条件。本实验中,利用垂直电泳和时间间歇法确立了DGGE分析绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲的变性剂梯度范围和电泳时间。机制生麦曲的变性剂梯度范围为50%~65%,电泳时间为5~5.5h;熟麦曲的变性剂梯度范围为40%~60%,电泳时间为4.5~5h。本研究证明了PCR-DGGE技术是一种能够快速分析黄酒麦曲中细菌群落的方法。通过PCR-DGGE对绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落结构进行分析,可以发现熟麦曲中细菌种类比机制生麦曲少,且熟麦曲鉴定出的细菌种类都包含于机制生麦曲中。这可能与两种麦曲的制作工艺和制曲时间有关。机制生麦曲的制曲时间需1个月左右,暴露在环境中的时间较长,导致其中含有的微生物种类较多;而熟