基于hplc法的中药复方中2个成分的含量测定

基于hplc法的中药复方中2个成分的含量测定

党参材料是桔梗科植物的党参（franch.）nanf。c.pilosulanatv.var.metsin）或c.consul.t.shen）或c.consul.adr.amove）的干燥根。它的味道又甜又平，属于脾脏和肺经络。具有补中益、健脾健肺的功效。2010年版《中国药典》中没有含量测定，但只有特定版本的党参糖含量。对党参物质质量的客观评价也很重要。主要报告了党参糖、白术素或养分含量等单质控制指标。然而，为了客观地评估党参材料的质量，只有特定的化合物才能控制其质量。在这项工作中，我们将党参物质的特定成分、党参物质元素和白术素作为指标，同时测定了这三种成分的党参材料的含量。考虑到多指标质量控制需要对照品的种类和量比较大,王智明等提出了一测多评的多指标质控模式,即在多指标质量控制时,以药材中对照品易得的典型成分为内标,建立该成分与其它成分间的相对校正因子,再通过校正因子计算出其它成分的含量.在方法实施时,可在只有一个对照品而其余对照品不足的情况下,实现这些成分的同步含量测定.并成功应用于木通、黄连、黄芩、人参、三七和吴茱萸等药材的质量控制,其中黄连药材的一测多评方法被2010年版《中国药典》采用.本实验以7个不同产地的党参药材为研究对象,以党参炔苷为参照物,建立其与党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ之间的相对校正因子;同时用外标法同步测定,验证一测多评法得到的结果.在评价党参药材时,用外标法测定党参炔苷,再通过校正因子计算得出党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的含量.1elicasinochromods-bp,dikmadiamesim18Waters1525-2487高效液相色谱仪,Breeze系统;EliteP230高效液相色谱仪,EC2000色谱工作站;色谱柱EliteSinoChromODS-BP(5μm,200mm×4.6mm),DikmaDiamonsilC18(5μm,200mm×4.6mm);党参药材来源见表1(P91).党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ对照品为本课题组自制,HPLC测定(面积归一化)纯度>98%.甲醇(Tedia公司)和乙腈为色谱纯(山东禹王实业有限公司),水为高纯水(自制),其余试剂均为分析纯.2方法和结果2.1测定混合对照品中某一组分对照品与其它组分相应组分间的相对校正因子.在一定的线性范围内,药材成分的量与检测器的响应值成正比,即:W=fA.通过分别测定混合对照品中几种成分的浓度及相应的检测值,建立其中某一组分(对照品量充足者)与其它组分间的相对校正因子.测定样品时,通过测定药材的结果某一组分的含量,用相对校正因子计算出其它组分在同一个样品中的含量.2.2测量和评估方法2.2.1流动相a-水梯度洗脱条件色谱柱:大连EliteSinoChromODS-BPC18(200mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱0～13min,体积分数25%A;13～30min,25%A升高到60%A;30～35min,60%A;35～40min,60%A降低到25%A;流速1mL·min-1,检测波长:220nm,柱温:25℃.进样量10μL.对照品及样品色谱图见图1(P92).2.2.2对照品溶液的制备精密称取党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ对照品适量,用甲醇溶解,制成浓度分别为74.4,19.3,110.4μg·mL-1的混合对照品溶液,同时配制一份6.20mg·mL-1的党参炔苷对照品,备用.2.2.3色谱条件的测定取过20目筛的党参药材样品粉末约5.0g,置于100mL具塞锥形瓶中,加入甲醇50mL,称重,超声0.5h,放凉,补重后过滤,旋干滤液,15mL水混悬后,用30mL的乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,旋干,甲醇溶解后定容至5mL量瓶中,摇匀,0.45μm滤膜过滤,照“2.2.1”项下的色谱条件测定.2.2.4线性范围考察依次精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液2,4,6,10,12,15μL,注入高效液相色谱仪,照“2.2.1”项下的色谱条件测定,记录峰面积.以进样量(X)对峰面积积分值(Y)进行回归处理,结果表明党参炔苷在0.15～1.12μg范围内线性关系良好,回归方程为Y=4.17×106X+1.55×105(r=0.9995);党参苷Ⅳ在0.04～0.29μg范围内线性关系良好,回归方程为Y=1.24×106X+9.46×103(r=0.9998);苍术内酯Ⅲ在0.22～1.66μg范围内线性关系良好,回归方程为Y=4.07×106X+1.61×105(r=0.9999).2.2.5平均质量含量测定取同一批党参药材(山西陵川)约5.00g,共6份,照“2.2.3”项下制备供试品溶液并测定,党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的平均质量含量分别为0.1436、0.0576和0.2118mg·g-1,RSD分别为2.97%,2.20%,1.75%.2.2.6色谱条件测定吸取混标溶液10μL,照“2.2.1”项下的色谱条件测定,重复进样6次,记录峰面积,计算党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ峰面积RSD的分别为2.28%,1.96%和1.39%.2.2.7峰面积rsd测定精密吸取同一供试品溶液,照“2.2.1”项下的色谱条件分别于4,6,8,10,12,24h测定,记录峰面积.分析得出党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的峰面积RSD分别为2.44%,1.84%和1.79%,说明样品在24h内稳定.2.2.8加样回收率试验称定已知含量的党参药材(山西陵川)约2.50g,共6份,分别加入含党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的对照品溶液2.5mL,挥干,照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,各吸取10μL,照“2.2.1”项下色谱条件测定,记录峰面积,计算加样回收率,党参炔苷、党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的加样回收率分别为99.3%、98.4%和97.8%,RSD分别为2.58%、2.16%和2.36%.2.2.9相对校正因子的计算以党参炔苷为内标,计算党参炔苷对党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的相对校正因子f党参炔苷/苷Ⅳ,f党参炔苷/苍术内酯Ⅲ,结果见表2(P93).2.3系统耐用性试验2.3.1色谱条件的选择取“2.2.2”项下对照品溶液,精密吸取10μL进样,照“2.2.10”项下计算党参炔苷对党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的相对校正因子.考察了EliteP230、Waters1525-24872种高效液相色谱系统和EliteSinoChromODS-BP(5μm,200mm×4.6mm)、DikmaDiamonsilC18(5μm,200mm×4.6mm)2种色谱柱,结果见表3.2.3.2峰定位判别结果利用相对保留时间(Rt)差定位:已知某典型成分的保留时间,加上相对保留时间差,并结合紫外吸收特征,即可判断出目标峰的位置,结果见表4.由表4可知,RSD<2%,表明利用相对保留值差进行峰定位是可行的.2.4质量控制试验取7种不同的党参样品,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,分别吸取10μL,按“2.2.1”项下色谱条件进行测定.利用一测多评法和外标法分别计算党参药材中党参苷Ⅳ和苍术内酯Ⅲ的含量,结果见表5.为确定“一测多评”法的准确性,我们用外标法进行比较.其含量间的相对标准偏差在4%以内,两种含量测定方法得到结果差异较小,表明一测多评法应用到党参药材的多指标质量控制是可行的.3产物的hplc测定本实验优化了党参药材的备样方法,比较了党参药材甲醇提取物的正丁醇和乙酸乙酯萃取物,比较HPLC图谱可以发现,正丁醇萃取物的杂质干扰样品目标峰的测定,而乙酸乙酯萃取物杂质干扰较小,因此,本实验选用乙酸乙酯萃取物进行HPLC测定.本实验测定的7个不同来源党参药材样品,湖北恩施市的板桥党中党参炔苷含量最高,而山西陵川的潞党参中含量最低;山西陵川药材基地的潞党参中党参苷Ⅳ含量最高,而山西交城县庞泉沟中含量最低;山西平