吴茱萸一测多评的含量测定

吴茱萸一测多评的含量测定

吴茱萸是广州科的一种植物，属于吴茱萸和石虎。这是一种重要的流行性疾病。我是singa。稍微多地出汗。血液。香蒲（jus.）一直很成熟。它具有加热和散寒、稀释肝脏和缓解疼痛的功效。它经常用于治疗腹部寒冷疼痛、呕吐、腹泻、头痛、胃痛、腹痛、疝痛、腹痛和痛经。生物碱是吴茱萸药材中的有效成分,现行版的《中国药典》也以吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量总和作为质量控制指标。但是,上述2个成分在吴茱萸药材中含量很低,并且研究发现这类成分在临床用药的水煎过程中煎出率很低(约10%)。而吴茱萸内酯等柠檬苦素类物质是吴茱萸中除生物碱之外的另一大类有效成分,研究表明吴茱萸内酯有很强的抗炎、镇痛、抗肿瘤等活性,并且在吴茱萸药材中的含量明显高于吴茱萸碱和吴茱萸次碱,文献报道,吴茱萸内酯、吴茱萸次碱和吴茱萸碱三者总含量可达到1%以上,因此笔者认为增加吴茱萸内酯作为吴茱萸质量控制指标更具合理性。目前已有用多个成分同步测定来控制吴茱萸质量的研究报道,但是对照品供应严重不足限制了该方法在实际的科研、生产和市场监督中的应用。针对这种现状,提出应用“一测多评”法(QAMS)开展吴茱萸多指标质量控制的研究设想。即只测定其中1个成分(吴茱萸次碱),通过建立该成分与其他有效成分(吴茱萸碱、吴茱萸内酯)间的相对校正因子,计算出其他成分的含量,实现多成分的同步测定。关于“一测多评”的研究思路已在木通、人参等药材得到验证,笔者分别建立了皂苷、生物碱等同类成分间的相对校正因子。本文建立了不同类成分之间的相对校正因子,重点探讨“一测多评”法在不同类成分之间应用的可行性与适应性。1仪器、试剂和仪器Waters2695-2996高效液相色谱系统,Empower2工作站;HP1100高效液相色谱系统,HP化学工作站)。AE240电子分析天平(METTLER)。KQ-100型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。乙腈为色谱纯(Fisher公司);水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。吴茱萸药材购自湖南、贵州、广西等省,经中国中医科学院中药研究所生药室何希荣主管药师鉴定,均为药典收载的品种。吴茱萸内酯(批号110800-200404),吴茱萸碱(批号110802-200505),吴茱萸次碱(批号110802-200505)购于中国药品生物制品检定所。2方法和结果2.1测定指标质量在一定的范围内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即W=fA。在吴茱萸的多指标质量评价时,以吴茱萸次碱为参照物,建立吴茱萸次碱碱与其他成分(吴茱萸碱、吴茱萸内酯)之间的相对校正因子;在实际测定时,用外标法测定吴茱萸次碱,再通过校正因子计算吴茱萸和吴茱萸内酯含量。同时用常规方法进行同步测定,以验证计算值的正确性和可行性。2.21个研究和多评价理论的研究2.2.1组分分离度试验℃;流速1.0mL·min-1。检测波长225nm;理论塔板数以吴茱萸碱计不低于3000,上述色谱条件下,各组分分离度良好。对照品与样品色谱图见图1。2.2.2对照品溶液的制备精密称取吴茱萸内酯4.8mg,吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品各0.70mg,置2mL量瓶中,用甲醇溶解稀释至刻度,并保存于4℃冰箱中,备用。2.2.3微生物滤膜制备取吴茱萸粉末(过40目筛)约0.5g,精密称定,置50mL三角瓶中,精密加入80%乙醇溶液25mL,称重,冷浸1h,超声40min,称重补失,摇匀,过0.22μm微孔滤膜,弃去初滤液,取续滤液备用。2.2.4吴新型斜波/收波长吴茱萸碱最大吸收波长在225nm,且230nm后吸收曲线陡降;吴茱萸次碱最大吸收波长在343nm,在220~240nm为强吸收肩峰;吴茱萸内酯的最大吸收波长为192nm,在225nm有较强的吸收。因此,要同时测定三者,以选择225nm为佳。吴茱萸内酯、吴茱萸碱,吴茱萸次碱在190~400nm进行全波长扫描。见图2。2.2.5吴两种植物氨基网络g结果精密吸取吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱系列混合标准溶液,分别进样10μL,测定峰面积积分值。以峰面积积分值对进样量进行回归处理,结果表明吴茱萸内酯在0.375~24.0μg呈良好的线性关系,回归方程为Y=1.48×105X+1.22×104(r=0.9999);吴茱萸碱在0.0547~3.50μg呈良好的线性关系,回归方程为Y=1.08×107X-4.47×105(r=0.9999);吴茱萸次碱在0.0547~3.50μg呈良好的线性关系,回归方程为Y=5.83×106X-5.07×103(r=0.9999)。2.2.6吴两种碱峰面积rsd取贵州1#供试品溶液,连续进样6次,每次进样10μL,结果吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积RSD分别为0.50%,0.57%和0.38%。仪器及进样精密度良好。2.2.7吴两种碱的质量分数取河南3#样品约0.5g,共6份,精密称定,按2.2.3项下制备供试品溶液并测定,6份样品中吴茱萸内酯的平均质量分数为1.06%,RSD1.3%,吴茱萸碱的平均质量分数为0.180%,RSD1.4%,吴茱萸次碱平均质量分数为0.133%,RSD0.78%(n=6),表明方法重复性良好。2.2.8吴基层弱碱峰面积研究取同一供试品溶液,分别在0,2,4,8,24h进样分析,每次进样10μL,记录峰面积,吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为2.3%,1.1%和2.3%。表明供试品溶液在24h内稳定。2.2.9加样回收回收率的测定精密称取河南3#样品共18份,每份约0.25g,随机选取其中6份样品精密加入含0.106g·L-1吴茱萸内酯的80%乙醇溶液25mL,随机选取另6份样品精密加入含0.0180g·L-1吴茱萸碱的80%乙醇溶液25mL,剩余6份样品中精密加入含0.0133g·L-1吴茱萸次碱的80%乙醇溶液25mL,按供试品溶液制备方法操作,计算各成分的加样回收率,结果见表1。2.2.1相对校正因子在一定的范围内成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比,即W=fA。在吴茱萸的多指标质量评价时,以药材中的吴茱萸次碱为内参物,建立吴茱萸次碱(rutacarpine,RU)与吴茱萸内酯(evodin,ED)、吴茱萸碱(evodiamine,EV)之间的相对校正因子。相对校正因子的定义如下:fsm=fsfm=Ws×AmWm×Asfsm=fsfm=Ws×AmWm×As公式(1)As,Am分别为内参物s和其他成分m的峰面积,Ws,Wm分别为内参物s和其他成分m的量。根据公式(1)求出吴茱萸内酯、吴茱萸碱相对于吴茱萸次碱的相对校正因子如下:fRU/ED=0.02534,fRU/EV=1.8492.3吴两种保水性的含量按供试品溶液处理方法制备了11批吴茱萸样品,分别精密吸取供试品溶液各10μL注入高效液相色谱仪,测定。采用外标法和“一测多评”法分别计算吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸内酯含量,结果见表2。从其含量间的相对标准偏差来看,在4%以内;表明两种含量测定方法得到的含量值之间差异不大,说明在吴茱萸的生物碱和内酯间应用“一测多评”法进行质量评价是可行的。2.4修正因素的重复回归2.4.1两种碱的相对校正因子取2.2.2项下系列混合对照品溶液,进样10μL测定,按2.2.10项下计算吴茱萸内酯、吴茱萸碱相对于吴茱萸次碱的相对校正因子。考察了Waters2695-2996、HP11002种高效液相色谱系统和EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm,5μm),KromasilC18(4.6mm×250mm,5μm)2种色谱柱,结果见表3。2.4.2目标峰的定位与紫外吸收特性的关系利用待测组分与内参物保留时间的比值(相对保留值)定位,已知内参物的保留时间,根据相对保留值(RT),结合紫外吸收特征,即能够判断出目标峰的位置。结果见表4。3讨论3.1证明可行性检验本实验研究建立了吴茱萸药材中不同类成分的“一测多评”测定法并证明其可行性。实验发现,以吴茱萸次碱为内参物,采用相对校正因子计算样品中其他两种成分的含量与实测结果误差最小,而以吴茱萸内酯或吴茱萸碱为内参物计算其他两种成分含量与实测结果误差大于5%。3.2柱温设定对测定结果的影响采用相同溶剂系统,考察比例的微小变化(乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸40.5∶58.5∶1∶0.2),检测波长的微小变化(224nm),柱温设定与否(30℃与室温),对QAMS法测定结果准确性的影响,结果计算值与实测值相比,RSD>5%。推测原因是上述微小变化可导致保留时间不一致,并引起峰面积显著变化,导致原相对校正因子变化大,影响准确性。3.3%乙醇的提取考察了50%,70%,100%甲醇和50%,80%,95%乙醇6种溶液对吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱、吴茱萸次碱提取效率的影响,结果表明以80%乙醇提取,3种成分提取效率均为最高。以80%乙醇做溶剂,比较超声和回流提取方法对提取结果的影响,结果差异不明显。以80%乙醇做溶剂,分别超声30,40,50min,结果40,50min均较30min提取完全,但40,50min差异较小。故确定以80%乙醇超声提取40min,考察了加25,50,100mL80%乙醇的提取效率,结果三者没有明显差别,故确定以25mL80%乙醇超声40min;浸泡30min和1h后超声提取40min,结果浸泡1h的峰面积明显高于浸泡30min,故确定以25mL80%乙醇,浸泡1h后超声40min。3.4酸及其不同比例洗脱系统实验比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-冰醋酸、乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸及其不同比例洗脱系统,结果发现乙腈-水-四氢呋喃-冰醋酸(41∶59∶1∶0.2)的分离效果最好且达到基线分离。流动相中加入冰醋酸,可以改善分离效果,防止拖尾,使峰形尖锐、对称,加入四氢呋喃增加了流动相对样品的溶解性。3.5测定结果的讨论含量测定结果发现,同一批样品中吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱3种成分的含量差异很大,吴茱萸内酯的质量分数范围在1.0%~47%,吴茱萸碱的质量分数范围在0.05%~1.4%,吴茱萸次碱的质量分数范围在0.06%~1.0%。吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱3种成分的含量差异很大,吴茱萸内酯的含量分别为吴茱萸碱的3至24倍;为吴茱萸次碱的4至29倍。而吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量差异较小,通常前者含量是后者的1至2.5倍。吴茱萸中吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量之和