细胞衰老过程中dna甲基化及甲基转移酶dnm1表达的改变

细胞衰老过程中dna甲基化及甲基转移酶dnm1表达的改变

细胞衰老是一种不可逆转的生长停滞，是人类衰老和年龄疾病的基本原因。体外培养的正常人成纤维细胞具有限定的增殖潜力，经过连续传代后逐渐变得衰老，即为细胞复制性衰老。此外，多种应激因素可以诱导细胞衰老的发生，过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)最常用于获得短时期内氧化应激诱导的细胞早衰。目前，衰老细胞的一些生物学特征，如端粒缩短、形态学改变、衰老相关β-半乳糖苷酶表达等已得到很好的阐述，然而，诱导细胞进入永久停滞状态的内在分子机制仍不清楚。基因组DNA甲基化状况是基因表观遗传微环境的基础之一，在细胞衰老的过程中，基因组DNA甲基化的变化具有其特定的规律。研究表明，特定基因调控位点甲基化的累积作用于细胞衰老，基因组DNA的甲基化状态影响细胞衰老过程中基因表达，染色质组装等。DNA甲基转移酶1(DNAmethyltransferase1,DNMT1)参与维持基因组DNA的甲基化状态。本研究以人胚肺成纤维细胞为研究对象，对比细胞复制性衰老及过氧化氢诱导的早衰过程中基因组DNA甲基化水平的变化，同时检测DNMT1的mRNA和蛋白表达变化，观察两种衰老过程中基因组DNA甲基化水平及DNMT1表达的差异。1材料和方法1.1材料表面人胚肺成纤维细胞(16PDL)购自中国医学科学院基础医学研究所;细胞受试物为质量浓度30%H2O2(M/V)购自英国BDH公司。1.2细胞复制性衰老人胚肺成纤维细胞用含体积分数为10%的新生小牛血清L-DMEM低糖培养基常规培养，详见文献。以公式n=3.32(logN2-logN1)+X计算群体倍增水平(populationdoublinglevels,PDL)，n为继代培养最终PDL,N2为该代细胞收获细胞数，N1为上代接种细胞数，X为上代细胞PDL。本实验在细胞复制性衰老过程中，正常人胚肺成纤维细胞分为22PDL(年轻细胞组)，35PDL(中年细胞组)，49PDL(复制性衰老细胞组)。同步培养22PDL正常人胚肺成纤维细胞约50%融合度时进行400μmol/LH2O2处理，每天用H2O2染毒工作液染毒1次，每次2h，共持续4d。经H2O2染毒4次后，继续培养7d，进入明显早衰持续状态，分为早衰起始组(prematuresenescenceinitiationgroup,PSi，染毒4次后)和早衰持续组(prematuresenescencepersistencegroup,PSp，继续培养7d)。1.35脉冲指数检测应用5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)抗体结合甲基化的DNA，原位检测DNA甲基化情况。去除培养基，1×磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution,PBS)清洗1次;4%多聚甲醛常温固定细胞至少15min;去离子水清洗3次，每次5min;冷甲醇固定5min;去离子水清洗1次5min;2NHCl于37℃孵育30min;去离子水清洗1次5min;1×TBE缓冲液室温孵育5min;去离子水清洗1次5min;1×PBS清洗1次5min;37℃于Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)含牛血清白蛋白(BSA,1%)中孵育30min;用PBST-BSA(含1%)稀释一抗，于37℃孵育1h;PBST清洗3次，每次5min;加入PBST稀释的二抗、异硫氢酸荧光素(fluoresceineisothiocyanate,FITC)标记，于37℃孵育30min;PBST清洗3次，每次5min;于0.2mg/ml荧光染料DAPI中染色2min;PBS清洗3次，每次5min;用抗荧光萃灭剂(FluoAntifadingMediumⅡ)封片，于荧光显微镜下观察。于50μlEp反应管中加入2μl(0.2μg)样品DNA,4USssI甲基化酶，1.5μmol/L未标记的SAM和SssI反应液，补水至25μl总体系，37℃孵育4h;同步，于50μlEp管中加入2μl(0.2μg)样品DNA,8U甲基酶Dam,1.5μmol/L3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)，1.5μmol/L未标记的SAM和Dam反应液，补水至25μl,37℃孵育4h;上述混合物分别于80℃温育20min终止反应;将反应混合液加入Millipore96孔板中，每孔中加入0.3ml5%三氯乙酸和0.3ml70%乙醇真空抽吸3次，洗去未结合DNA的3H-SAM。取出板的底座，每孔加入固体闪烁液100μl，在microbeta液闪仪器上检测每个孔对应的脉冲指数(centsperminute,CPM)值。根据公式%甲基CpG=(1-SssI/3.2dam比值)×100来计算基因组甲基化程度。1.5dnmt1的性能变化1.5.1荧光定量pcr和反转录合成dna应用Trizol试剂(Invitrogen)提取细胞总RNA,MMVReverseTranscriptionKit(Fermentas)反转录合成cDNA，荧光定量PCR采用SYBRue5f8PremixExTaqTM(PerfectRealTime)(TaKaRa)试剂。DNMT1上游引物5′-CCCCTGAGC-CCTACCGAAT-3′，下游引物5′-CTCGCTGGAGTG-GACTTGTG-3′;内参ACTB上游引物5′-TGAC-CCAGATCATGTTTGAG-3′，下游引物5′-ATCTCTT-GCTCGAAGTCCAG-3′。1.5.2westernblot检测细胞蛋白表达水平采用RIPA裂解液(50mmol/LTris-HCl,pH=7.5,150mmol/LNaCl,1%NonidetP40,0.5%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS)提取细胞总蛋白，一抗DNMT1(rabbit,Sigma)，GAPDH(sc-32233,SantaCruz)，二抗goatanti-rabbitIgG-HRP(sc-2031,SantaCruz)，goatanti-mouseIgG-HRP(sc-2005,SantaCruz)，进行WesternBlot检测蛋白表达水平变化。1.6两组本间的比较数据用x珋±s表示，采用Student’st-test检验进行两样本之间的比较，用SPSS13.0统计软件进行分析，检验水准为α=0.05.2结果2.15不同年龄处理的基因组dna甲基化水平利用5-甲基胞嘧啶抗体进行细胞免疫荧光检测，观察甲基化DNA的定位及进行各组之间平均荧光强度变化趋势的比较，从而检测基因组DNA甲基化的变化趋势。如图1所示，在细胞复制性衰老过程中，年轻细胞组平均荧光强度为56.7，中年细胞组有所降低为41.5，而复制性衰老细胞组降低明显为20.3,5-mC免疫荧光强度随增龄逐渐降低;早衰组细胞也呈现相同的变化趋势，早衰起始组为48.6，而早衰持续组为23.1。因此，与年轻细胞相比，衰老的细胞具有较低的基因组DNA甲基化水平。利用液闪计数的原理，检测基因组DNA的总体5-mC内容物含量，从而确定基因组DNA的甲基化水平的改变，掺入[3H]甲基SAM的量越多，表明基因组DNA的甲基化水平越低。计算甲基化的CpG岛含量，以百分比表示，结果如图2所示，精子DNA作为阴性对照，甲基化CpG岛的含量为5.0%，完全甲基化DNA作为阳性对照，含量为95.0%。在细胞复制性衰老过程中，年轻细胞组含量为68.2%，中年细胞组有所降低，为41.9%，复制性衰老细胞组最低为16.1%，甲基化CpG岛的含量呈下降趋势;对于处理组细胞，早衰起始组为63.5%，早衰持续组为18.0%，在细胞持续衰老的过程中，甲基化CpG岛的含量也呈现明显的下降趋势。[3H]甲基掺入实验表明，与年轻细胞相比，衰老的细胞具有较低水平的基因组DNA甲基化CpG岛含量。2.3dmnt1抗体对mna表达的影响通过RT-Q-PCR检测各组细胞甲基化相关酶的mRNA相对表达水平，如图3所示，在细胞复制性衰老过程中，DNMT1的mRNA相对表达水平以22PDL年轻细胞组的表达量为对照，设为1，其余各组的表达水平与之相比较，中年细胞组无明显改变，复制性衰老细胞组降低75%，H2O2处理后，早衰起始组表达升高至1.84倍，而早衰持续组降低80%。应用DNMT1抗体进行蛋白印迹，其蛋白表达与mRNA表达具有相同的变化趋势(图4)。因此，在细胞复制性衰老过程中，与年轻细胞相比，复制性衰老细胞组DNMT1明显降低，对于H2O2诱导的细胞早衰过程中，DNMT1表达呈下降趋势，早衰组DNMT1的表达水平同复制性衰老组。3细胞复制性衰老及叶片dna甲基化水平变化基因组DNA的甲基化状态是表观遗传调控模式的重要方面。DNA甲基化的升高和降低与衰老过程相联系，甲基化的改变经常以年龄相关的模式发生。在一些组织中，衰老细胞中甲基化的胞嘧啶水平降低，这种去甲基化状态可以启动染色体的不平衡和重排，从而增加一些年龄相关疾病的风险。本研究通过5-甲基胞嘧啶免疫荧光实验、[3H]甲基掺入实验分别定性和定量检测细胞衰老过程中基因组DNA甲基化水平的变化情况。在人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中，基因组DNA甲基化整体趋势逐渐下降，复制性衰老细胞组整体DNA甲基化水平最低;同样，在H2O2诱导的细胞早衰过程中，基因组整体甲基化趋势也是逐渐降低，早衰持续组基因组DNA甲基化水平最低，因此，基因组DNA甲基化水平的降低不仅与年龄有关，而且还受氧化应激的影响，基因组DNA低甲基化状态是衰老细胞的伴随特征;基因组DNA的低甲基化与年龄、氧化应激都有一定的关联，而对甲基化水平的最终决定作用，取决于两种因素作用于细胞的力量对比。然而，造成基因组DNA甲基化水平随年龄改变的机制仍不清楚，DNMT1随年龄表达降低，其可能作用于甲基化胞嘧啶内容物的整体降低。有研究报道，应用8-OH-鸟嘌呤取代鸟嘌呤，发现邻近胞嘧啶的甲基化显著改变，这一改变具有高度的位置特异性，氧自由基一定程度上改变所观察的甲基化状态。氧化剂能够改变细胞内谷胱甘肽的水平，通过降低SAM的可利用度而影响DNA甲基化，而且也可以削弱细胞内甲基转移酶对靶胞嘧啶甲基化的能力;单一的5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟甲基胞嘧啶，能显著抑制甲基化结合蛋白(Methy1-BindingDomainProtein,MBD)与寡核苷酸复合体的结合，从而降低结合能力。本研究又从甲基转移酶的表达变化寻求基因组DNA甲基化水平改变的原因，在细胞复制性衰老过程中，DNMT1表达随增龄呈下降趋势。在WI-38成纤维细胞衰老过程中，DNMT1的mRNA表达水平降低，与本实验部分结果一致。对于早衰起始组，H2O2处理4d之后，DNMT1表达升高，而随着早衰程度的加