代谢工程理论在啤酒发酵过程中的应用

代谢工程理论在啤酒发酵过程中的应用

在啤酒生产中，母乳素代谢过程极其复杂，有许多代谢产品。一些代谢产品是啤酒中的一种令人满意的物质。然而，如果超出一定含量，这将影响啤酒的口味。高级醇是酵母发酵的主要副产物，是啤酒的风味成分之一，适宜的含量会给人以醇厚、丰满之感，饮后有愉快的感觉，如果含量偏高，不但会给啤酒带来不愉快的后苦味，还会令饮者有“上头”的感觉。双乙酰也是啤酒中的重要风味物质，但含量过高会影响啤酒的品质。双乙酰的口味界限值很低，仅为0.1～0.15mg/L，超过此阈值会给啤酒带来不愉快的馊饭味。另外，啤酒中嘌呤类物质也是亟待解决的一个重要问题。因此，控制啤酒中风味物质的含量对提高啤酒质量、改善啤酒风味有着十分重要的意义。由于啤酒发酵过程中涉及的问题多而复杂，用实验的方法展开研究，不仅所需信息较多，还要耗费大量的人力物力，而代谢工程的理论分析可以避免一些繁琐的实验。因此，本文对啤酒发酵的代谢工程展开了初步探讨。1生物质合成代谢网络酿酒酵母的代谢，主要包括糖酵解途径（EMP），戊糖磷酸途径（PP），柠檬酸循环（TCA）。将以上的各反应连在一起就形成了酿酒酵母的代谢网络，但此网络过于庞大和复杂，对数据处理会造成不便，所以有必要进行简化。(1)中间代谢物只考虑节点。有的中间代谢物只有一种产物，没有其他分支产物，由于计量学模型的基础是拟稳态，即生成的代谢物流等于消耗的代谢物流，对于此类中间代谢物可以忽略。(2)对于代谢物流很小的反应路径可以忽略。这样代谢物就减少为20个。啤酒酵母在发酵前期，由于氧的参与而首先进行细胞的合成，所以对啤酒生产过程中的代谢通量分析就必须考虑到细胞合成。生物质合成涉及的代谢网络非常复杂，常进行简化处理。一般方法是将生物质合成网络简化为对中心代谢系统中的前体以及能量和还原力的需求速率。对生物合成代谢网络的分析表明，所有生物质成分均由细胞中心代谢系统的12种前体合成得到（但赖氨酸、甲硫氨酸合成中涉及到的琥珀酰CoA生成琥珀酸，可认为其与琥珀酸生成琥珀酰CoA的反应耦合，净反应是消耗了ATP。因此可不考虑琥珀酰CoA的要求，而仅考虑11种前体物质），由此可用一个总反应方程来表示细胞的生长过程：其中系数Xi为前体需求系数，其单位一般为mmol前体∕gDCW(细胞干重)，可由生物质合成的代谢路径及测得的细胞组成数据计算得到。经过查阅文献得到x1=0.9,x2=1.1,x3=0.6,x4=4.1,x5=1.2,x6=4.1,x7=2.1,x8=9.2,x9=4.3,x10=5.4,x11=7.7,x12=16.1,x13=16.3,x14=-2.9,x15=-3.5经过如此简化后得到的包含EMP,PP及TCA的酿酒酵母生物质合成代谢网络如图1所示。其中线性反应均简化为一个反应，NA,NP分别表示NADH,NADPH。2注意反应方程中计量系数的转换简化的酿酒酵母代谢网络中的反应方程，以碳元素平衡为基准，即所有的速率单位均统一为c·mol/L·g。因为采用碳的摩尔数基准可以更方便地表示细胞内的代谢通量的分布。由于代谢网络中的速率均是针对某一代谢反应，所以针对某一中间代谢物列准稳态方程时要注意反应方程中计量系数的转换。在此基准上，可以得到以下方程的计量关系：NP:16.1rx-0.3r1=0（假设生成的NP只用于生物质合成过程中提供还原力，NA为NADH,NP为NADPH)设上述方程系数矩阵为S,速率向量为：则上述方程的矩阵形式为：写出计量矩阵S，分析可知S的秩为20，而总速率个数为24，则该代谢系统自由度为4，测出4个速率即可完全确定代谢网络中的通量分布。3啤酒发酵过程中酵母代谢的变化在啤酒发酵过程中，由于啤酒发酵罐的高度和产生二氧化碳的原因，酵母在发酵液中受到一定的压力。来自啤酒厂的数据表明，酵母在发酵过程中大约受到0.3MPa的压力。因此可以通过加压发酵来考察压力对酵母发酵的影响。0.5MPa（氮气压力）压力下与常压下的对照实验数据见图2，图3和图4。从图2可以看出，该压力下酵母每天的耗糖比对照样要分别少18.5%,36.6%,23.4%和40.0%。从图3可以看出，压力对酵母发酵生成乙醇也有一定的抑制，在压力作用下，酵母每天生成乙醇的量比对照样分别少14.0%,10.5%,21.6%和15.0%。从图4可以看出，在发酵前3天，双乙酰生成总量比还原的多，所以每天都有双乙酰的生成，但是在压力作用下每天的生成量比对照样分别少19.2%,28.0%和60.3%。进入第4天，由于酵母生长代谢基本完成，酵母不再生成双乙酰，所以双乙酰的含量由于还原作用而开始下降，但是在压力作用下，酵母对双乙酰的还原能力降低了7.5%。由以上数据可以表明，在压力作用下，酵母在啤酒发酵过程中的代谢受到了抑制，包括耗糖、乙醇生成、双乙酰生成和还原速率都比对照样小。通过测定的外部速率及上述得到的计量矩阵，估算代谢网络中主要节点的内部速率，结果见表1。从表1可以看到，细胞合成的代谢通量在两种条件下，由于氧的消耗而整体趋于减小，而在同一天内，在压力作用下细胞合成的代谢通量比对照样低很多，磷酸戊糖途径的代谢通量也明显小于对照样。通过比较发现，在压力条件下，和细胞合成有关系的磷酸戊糖途径、TCA循环受到的抑制较大，然而与进入EMP途径的通量和随后合成乙醇的通量相比较受到的抑制要小一些，所以在乙醇的生成上，加压作用下同常规压力下的通量差距不如其他节点的差距明显。4啤酒发酵