三叶青总黄酮提取工艺的研究

三叶青总黄酮提取工艺的研究

三叶青是三项植物：葡萄科夏枯草科和夏枯草科的干燥部位。具有清热解毒、驱风解粘液、活血止痛的功效。它可以用来治疗高烧、肺炎、哮喘、肝炎、月经不调、喉咙痛、狼尾草、伤口等疾病。黄酮是三叶青中的主要有效成分,药理实验表明其具有抗肿瘤、保肝等作用。笔者对三叶青中总黄酮的提取工艺进行了研究,旨在优选其最佳提取工艺。1仪器、试剂和试药UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津);MARS5微波消解仪(美国CEM公司);KH2200型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);BS124S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。三叶青(衢州南孔中药有限公司中药饮片厂提供,批号为1010001,产地为广西);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号为100080-200707);亚硝酸钠、硝酸铝(上海振欣试剂厂);氢氧化钠(杭州高晶精细化工有限公司);其余试剂均为分析纯。2方法和结果2.1黄酮的总含量为2.1.1对照品溶液的制备精密称取于120℃干燥3h至恒重的芦丁对照品11.89mg,置25mL量瓶中,加50%乙醇适量,超声处理使溶解,放冷,加50%乙醇至刻度,摇匀,作为对照品溶液(含芦丁0.4756mg·mL-1)。2.1.2供试品溶液的制备取三叶青0.3g,精密称定,置微波消解管中,用60%乙醇7.5mL微波(功率450w)提取15min,过滤,浓缩至干,用50%乙醇转移至25mL量瓶中,定容,摇匀,作为供试品溶液。2.1.3扫描波长的确定精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1mL,分别置25mL量瓶中,各加50%乙醇至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%氢氧化钠试液10mL,再加50%乙醇至刻度,摇匀,放置15min,以相应试剂为空白,分别在400～600nm波长范围内进行扫描。结果对照品溶液和供试品溶液均在504nm波长附近有最大吸收峰,故确定测定波长为504nm。2.1.4试验与结果①标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mL,分别置25mL量瓶中,按“2.1.3”项下操作,在504nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标,对照品的质量浓度C为横坐标,绘制标准曲线,得回归线性方程:A=9.6089C+0.0532,r=0.999(n=6)。结果表明,芦丁的质量浓度在0.0190～0.0666mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。②精密度试验:精密吸取供试品溶液2.5mL,按“2.1.3”项下操作,于504nm波长处测定吸光度,连续测定6次。结果平均吸光度为0.657,RSD=0.19%(n=6),表明仪器精密度良好。③稳定性试验:精密吸取供试品溶液2.5mL,按“2.1.3”项下操作,分别于室温放置0,15,30,45,60,120min后,于504nm波长处测定吸光度。结果平均吸光度为0.655,RSD=1.99%(n=6),表明供试品溶液在2h内稳定。④重现性试验:取同一批样品6份,每份0.3g,精密称定,按供试品溶液制备方法制备溶液,精密吸取2.5mL,按“2.1.3”项下操作,于504nm波长处测定吸光度,并计算含量。结果平均含量为51.63mg·g-1,RSD为2.49%(n=6),表明方法重现性好。⑤加样回收试验:取已知含量(51.63mg·g-1)的样品约0.15g,共6份,精密称定,加入适量的芦丁对照品,按供试品溶液制备方法制备溶液,精密吸取2.5mL,按“2.1.3”项下操作,于504nm波长处测定吸光度,计算回收率。回收率分别为97.21%,95.61%,96.12%,95.11%,95.09%,101.16%,平均96.72%,RSD=2.39%(n=6)。2.2最佳超声提取工艺的确定因素水平确定:采用L9(34)正交设计表,对乙醇浓度(因素A)、乙醇用量(因素B)、提取时间(因素C)、提取次数(因素D)4个因素进行考察,因素水平表(见表1)。正交试验方法与结果:取9份三叶青,每份5g,准确称量,按照表1中的试验条件制备三叶青提取液(提取次数在2次或2次以上的合并提取液),依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。正交试验结果及方差分析(见表1、2、3)。由表1、2、3可知,影响因素主次顺序为D>C>B>A,D因素对其有显著性影响。优选出最佳超声提取工艺为A2B3C3D3,即加12倍量60%乙醇,超声提取3次,每次提取2h。验证试验:取同一批三叶青药材3份,每份各取5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,按照优选出的最佳工艺超声提取,依法测定吸光度,计算样品中总黄酮的含量。结果3份样品中总黄酮含量平均值为34.72,35.15,34.91mg·g-1,平均34.93mg·g-1,RSD=0.61%(n=3)。2.3最佳回流提取工艺的确定因素水平确定:采用L9(34)正交设计表,对乙醇浓度(因素A)、乙醇用量(因素B)、提取时间(因素C)、提取次数(因素D)4个因素进行考察,因素水平表(见表4)。正交试验方法与结果:取9份三叶青,每份5g,准确称量,按照表4中的试验条件制备三叶青提取液(提取次数在2次或2次以上的合并提取液),依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。正交试验结果及方差分析(见表5、6)。由表5、6可知,影响因素主次顺序为D>A>C>B,D因素对其有显著性影响。考虑到溶剂倍量为次要因素,对结果的影响较小,故最佳回流提取工艺为A2B1C1D2,即加8倍量60%乙醇,回流提取2次,每次提取1h。验证试验:取同一批三叶青药材3份,每份各取5g,精密称定,置圆底烧瓶中,按照优选出的最佳工艺回流提取,依法测定吸光度,计算样品中总黄酮的含量。结果3份样品中总黄酮含量平均值为39.44,39.81,38.94mg·g-1,平均39.40mg·g-1,RSD=1.11%(n=3)。2.43-绿色总黄酮微波提取技术的选择2.4.1料液比对总黄酮提取率的影响取5份三叶青,每份0.3g,准确称量,在醇浓度为60%、提取时间为15min、微波功率为400w的条件下,考察料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30时对总黄酮提取率的影响。依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。结果表明料液比在1:25时提取率较高,因此固定料液比进行正交试验。2.4.2乙醇浓度对总黄酮提取率的影响取5份三叶青,每份0.3g,准确称量,在料液比为1∶25、提取时间为15min、微波功率为400w的条件下,考察乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%时对总黄酮提取率的影响。依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。结果表明乙醇浓度在50%、60%、70%时提取率较高,因此选择其进行正交试验。2.4.3微波功率对总黄酮提取率的影响取5份三叶青,每份0.3g,准确称量,在醇浓度为60%、料液比为1∶25、提取时间为15min的条件下,考察微波功率分别为100w、200w、300w、400w、500w时对总黄酮提取率的影响。依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。结果表明微波功率在300w、400w、500w时提取率较高,在正交试验时选择350w、400w、450w进行试验。2.4.4微波时间对总黄酮提取率的影响取5份三叶青,每份0.3g,准确称量,在醇浓度为60%、料液比为1∶25、微波功率为400w的条件下,考察微波时间分别为5min、10mim、15min、20min、25min时对总黄酮提取率的影响。依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。结果表明微波时间在15min、20min、25min时提取率较高,因此选择其进行正交试验。2.4.5微波提取工艺的确定因素水平确定:为了确定微波提取总黄酮的最佳工艺条件,采用L9(34)正交表,固定料液比,以乙醇浓度(因素A)、微波功率(因素B)、微波时间(因素C)3个因素,选取各因素的较优区域3个水平做正交试验,因素水平表(见表7)。正交试验方法与结果:取9份三叶青,每份0.3g,准确称量,按照表3-1中的试验条件制备三叶青提取液(提取次数在2次或2次以上的合并提取液),依法测定吸光度,计算三叶青总黄酮的含量。正交试验结果及方差分析(见表8、9)。由表8、9可知,影响因素主次顺序为A>B>C,A、B因素对其有显著性影响。微波时间15min和25min时所得结果近似,故从成本考虑,选择微波时间为15min,优选出最佳微波提取工艺为A2B3C1,即料液比1∶25,60%乙醇,微波功率450w,微波时间15min。验证试验:取同一批三叶青药材3份,每份各取0.3g,精密称定,置微波消解管中,按照优选出的最佳工艺微波提取,依法测定吸光度,计算样品中总黄酮的含量。结果3份样品中总黄酮含量平均值为52.19,52.17,51.20mg·g-1,平均51.86mg·g-1,RSD=1.09%(n=3)。3微波提取工艺条件的稳定性和较低性通过回流