环境生物化学第五章

5现代环境生物

技术原理

Contents1.现代生物技术概述

2.酶工程基本原理

3.基因工程基本原理

4.微生物细胞工程环境生物化学

5.1现代生物技术概述5.1.1现代生物技术定义1986年国家科委制订《中国生物技术政策纲要》时，将生物技术定义为：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。环境生物化学

现代生物技术定义

先进的工程技术手段是指基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程等新技术。改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。生物原料则是指生物体的某一部分或生物生长过程中所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化合物，甚至某些矿石。环境生物化学

现代生物技术定义为人类生产出所需的产品包括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等各种产品。目的则包括疾病的预防、诊断与治疗，环境污染的检测与治理等。环境生物化学

5.1现代生物技术概述5.1.2现代生物技术及应用现代生物技术主要包括：基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程。这些技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的（图5-1）。其中基因工程技术是核心技术，它能带动其他技术的发展，如通过基因工程对细菌或细胞改造后获得的工程菌或细胞，必须通过发酵工程或细胞工程来生产有用物质。环境生物化学

现代生物技术及应用图5-1基因工程、酶工程、细胞工程与发酵工程之间的关系环境生物化学

现代生物技术及应用生物技术已广泛应用于农业、医药、化工、食品、环境保护等众多领域。生物技术的应用过程示意图如图5-2所示。环境生物化学

现代生物技术及应用图5-2生物技术的应用过程示意图环境生物化学

5.1现代生物技术概述5.1.3现代环境生物技术（1）环境生物技术的产生由于人口的快速增长，自然资源的大量消耗，全球环境状况目前正在急剧恶化：水资源短缺、土壤荒漠化、有毒化学品污染、臭氧层破坏、酸雨肆虐、物种灭绝、森林减少等。人类的生存和发展面临着严峻的挑战，迫使人类进行一场“环境革命”来拯救人类自身。在这场环境革命中，环境生物技术担负着重大使命，并且作为一种行之有效、安全可靠的手段和方法，起着核心的作用。环境生物化学

现代环境生物技术现代环境生物技术是现代生物技术应用于环境污染防治的一门新兴边缘学科。它诞生与20世纪80年代末期，以高新技术为主体，并包括对传统生物技术的强化与创新。环境生物技术涉及众多的学科领域，主要由生物技术、工程学、环境学和生态学等组成。它是由生物技术与环境污染防治工程及其他工程技术紧密结合形成的，既具有较强的基础理论，又具有鲜明的技术应用特点。环境生物化学

现代环境生物技术广义上讲，凡是自然界中涉及环境污染控制的一切与生物技术有关的技术，都可称为环境生物技术。德国国家生物技术研究中心的K.Timmis博士将环境生物技术定义为应用生物圈的某些部分使环境得以控制，或治理预定要进入生物圈的污染物的生物技术。

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包括以下三方面1在环境中应用的生物技术，这是相对于一些在高度控制条件下的密闭反应器中进行的生物技术而言；

2涉及到环境中某些可以看作为一个生物反应器部分的生物技术

.3作用于一些必定要进入环境的材料的生物技术

.环境生物化学

现代环境生物技术美国密歇根州立大学的J.M.Tiedje教授认为，环境生物技术的核心是微生物学过程。近年来，环境生物技术发展极其迅猛，已成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境问题的最有效手段。国际上认为21世纪生物技术产业化的十大热点中，环境污染监测、有毒污染物的生物降解和生物降解塑料三项属于环境生物技术的内容。

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现代环境生物技术严格地说，环境生物技术指的是直接或间接利用生物或生物体的某些组成部分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的生产工艺，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术。环境生物技术作为生物技术的一个分支学科，它除了包括生物技术所有的基础和特色之外，还必须与污染防治工程及其他工程技术相结合。环境生物化学

现代环境生物技术环境生物技术可分为高、中、低三个层次。高层次是指以基因工程为主导的现代污染防治生物技术，如基因工程菌的构建、抗污染型转基因植物的培育等；中层次是指传统的生物处理技术，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理论和技术背景下产生的强化处理技术和工艺，如生物流化床、生物强化工艺等；环境生物化学

现代环境生物技术低层次是指利用天然处理系统进行废物处理的技术，如氧化塘、人工湿地系统等。环境生物化学

现代环境生物技术环境生物技术的三个层次均是污染治理不可缺少的生物技术手段。高层次的环境生物技术需要以现代生物技术知识为背景，为寻求快速有效的污染治理与预防新途径提供了可能，是解决目前出现的日益严重且复杂的环境问题的强有力手段。中层次的环境生物技术是当今废物生物处理中应用最广泛的技术，中层次的技术本身也在不断改进，高技术也不断渗入，因此，它仍然是目前环境污染治理中的主力军。低层次的环境生物技术，其最大特点是充分发挥自然界生物净化环境的功能，投资运行费用低，易于管理，是一种省力、省费用、省能耗的技术。环境生物化学

现代环境生物技术各种工艺与技术之间可能存在相互渗透或交叉应用的现象，有时难以确定明显的界限。某项环境生物技术可能集高、中、底三个层次的技术于一身。

为了解决日益严重的环境污染问题，需配合使用高、中、低三个层次的技术，针对不同的问题，采用不同的技术或不同技术的组合。环境生物化学

现代环境生物技术（2）环境生物技术的研究范围现代环境生物技术应用现代生物技术服务于环境保护，目前环境生物技术面临的任务有：

①解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题；环境生物化学

现代环境生物技术②开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用废物生产生物能源，如甲烷、氢气、乙醇等；③建立无害化生物技术清洁生产新工艺，如生物制浆、生物絮凝剂、煤的生物脱硫、生物冶金等；④发展对环境污染物的生理毒性及其对生态影响的检测技术。环境生物化学

现代环境生物技术现代生物技术的发展，给环境生物技术的纵深发展增添了强大的动力，生物技术无论是在生态环境保护方面，还是在污染预防和治理方面以及环境监测方面，都显示出独特的功能和优越性。环境生物技术也面临许多难题，而这些难题的解决，依赖于现代生物技术的发展去开辟道路。人们有理由、有信心相信，最终环境问题解决的希望寄托在现代环境生物技术的进展和突破上。环境生物化学

5.2酶工程基本原理酶工程是研究酶的生产和应用的一门新的技术性学科，是利用酶的催化作用进行物质转化（合成有用物、分解有害物）的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术。酶工程的内容包括：酶的生产与分离纯化、酶分子修饰、酶固定化、酶反应动力学与反应器和酶的应用等方面。环境生物化学

5.2酶工程基本原理酶工程的主要任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能，即利用酶的特定功能，借助工程学手段为我们提供产品或分解有害物质。环境生物化学

5.2酶工程基本原理酶工程的目的是：为我们提供产品或以特定的功能来为我们服务。本节主要介绍酶固定化、固定化酶反应动力学及酶在污染治理中的应用等方面。环境生物化学

酶固定化概念5.2.1酶固定化概念酶的固定化技术就是通过物理或化学方法将酶束缚在一定区间内制成仍具有催化活性的酶的衍生物即固定化酶(immobilizedenzyme)。环境生物化学

酶固定化概念酶是生物体为维持自身的生命活动而产生的，它适于在生物体内进行化学反应。但是，作为人类用于生产所需要的催化剂还不够理想。例如，酶在一般情况下，对热、强酸、强碱和有机溶剂等均不够稳定，即使给予合适的条件也会随着反应时间的延续，反应速度逐渐下降最后导致失括。同时，酶也不能反复利用且酶只能在水溶液中使用，不能在有机溶剂中使用。而固定化酶能克服上述的缺点，它像有机化学反应中所使用的固体催化剂一样，同时仍具有生物体内酶一样强的催化活性。

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酶固定化概念固定化酶具有下列优点：可以使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中回收；酶的稳定性有所改进；酶的使用效率提高。

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酶固定化概念酶的固定化使酶的应用达到新的水平，可把酶直接应用于化学工业的反应系统。固定化酶的研究不仅具有实用价值，在探索酶的作用机制方面也提供了新的研究途径。环境生物化学

酶固定化概念固定化酶的研究开始于20世纪50年代。1953年格仑布霍费(Grubhofer)和施莱思(schleith)将聚氨苯乙烯树脂重氮化，并将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶或核糖核酸酶等结合固定到该树脂上，第一次实现了酶的固定化。经过十多年的努力，到了60年代后期，固定化酶已经广泛应用于食品、医药和发酵等工业的生产。1978年，我国首次使用固定化5’—磷酸二酯酶生产5’—核苷酸。到70年代初，出现了固定化细胞，细胞的固定化包括微生物细胞、动物细胞、植物细胞或各种细胞器的固定化。环境生物化学

酶固定化概念固定化酶和固定化细胞研究的第一阶段主要是载休的开发，固定化方法的研究及其应用技术的开发。目前，第一阶段已基本完成，进入了第二阶段的研究。第二阶段的主要研究内容可归纳如下：①在需要辅酶(NAD+或FAD)或ATP、ADP、AMP的酶反应体系的固定化中，辅酶系或ATP、ADP、AMP系和其再生系的建立；②疏水体系或含水很低的体系里固定化酶的催化反应的研究；③为了防止固定化过程中酶活力下降，添加辅助物的研究：④固定化活细胞的研究。总之，酶和细胞固定化技术发展迅猛，它的应用将会引起应用酶学及生物工程学的巨大变革。环境生物化学

酶固定化概念⑴固定化酶的制备酶的催化活性依赖于酶的空间结构及活性中心。所以在固定化时，要选择适当的条件，力图不使其活性中心的基团受到影响。操作时应尽量在温和条件下进行，避免高温、强酸、强碱处理，以尽量保持酶蛋白天然的高级结构。环境生物化学

酶固定化概念酶固定化的方法很多，但没有一种对任何酶都适用的通用方法。目前采用的固定化方法大致可分为3类，载体结合法(包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法)、交联法和包埋法（包括聚合物包埋法、微胶囊包埋法)。图5-3为几种常用的酶固定化方法示意图。环境生物化学

酶固定化概念图5-3酶固定化方法示意图(1)离子结合，(2)共价结合；(3)交联；(4)聚合物包埋；(5)疏水作用i(6)脂质体包埋；(7)微胶囊环境生物化学

酶固定化概念上述几种方法也可并用，称为混合法。例如：交联和包埋并用，离子结合和包埋并用，共价结合和包埋并用等。现将各种方法的原理及优缺点简要介绍如下：环境生物化学

酶固定化概念①裁体结合法载体结合法是用共价键、离子键和物理吸附法把酶固定在纤维素、琼脂糖、左旋糖酐、甲壳质、多孔性玻璃和离子交换树脂等载体的固定化。环境生物化学

酶固定化概念a共价结合法：利用酶蛋白分子中的氦基酸残基与载体上的基团通过化学反应形成共价键而使酶固定化的方法。共价结合的具体方法很多，可分为重氮法、肽法、烷化法和载体交联法等。其中，重氮法最为常用。共价结合法要求控制条件较苛刻，反应激烈，操作复杂，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心破坏，难以制得高活力的标准品，有时会使酶原来具有的底物特异性发生变化。但此方法制得的固定化酶的酶分子和裁体间结合极牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液处理也不会使酶分子从载体上脱落。环境生物化学

酶固定化概念b离子结合法：通过离子效应，将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上。常用的载体有DEAF—纤维素、TEAE—纤维素、ECTROLA—纤维素及DEAE-交联葡聚糖等阴离子交换性载体。与共价结合法相比较，离子结合法的操作简便，处理条件较温和，酶分子的高级结构和活性中心很少改变，可得到活性较高的固定化酶。但载体和酶分子之间的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响，在离子强度较大的状态下进行反应，有时酶分子会从载体上脱落下。环境生物化学

酶固定化概念c物理吸附法：是将酶分子吸附到不溶于水的惰性载体上。常用的载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭土、矾土、硅胶、磷酸钙凝胶、羟基磷灰石、淀粉等。其中以活性炭应用最广，例如把吸附有霉菌糖化酶的活性炭装入柱内，以适当流速道人淀粉溶液，流出液中可以获得葡萄糖。物理吸附法不会明显改变酶分子的高级结构，因此不易使酶分子活性中心受到破坏。其缺点是酶分子与载体的相互作用较弱，被吸附的酶分子极易从载体上脱落。

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酶固定化概念②交联法交联法是利用双功能试剂的作用，在酶分子之间发生交联，凝集成网状结构而制成的固定化酶。双功能试剂主要有戊二醛、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物。酶蛋白中游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。其中以戊二醛法最为常用。戊二醛和酶蛋白的游离氨基形成席夫(Schiff)碱而使酶分子交联。交联法与共价结合法一样，反应条件比较剧烈，固定化酶的活力较低。又由于交联法制备的固定化酶颗粒较细，此法不宜单独使用，如与吸附法或包埋法联合使用好效果。又由于交联法制备，则可达到加固的良好效果。环境生物化学

酶固定化概念③包埋法包埋法是将酶包埋在聚合物凝胶的微细网格中或被半透性的聚合物膜所包围，使酶分子不能从凝胶的网格中或膜中漏出，而小分子的底物和产物则可以自由通过凝胶网格和半透膜。环境生物化学

酶固定化概念a聚合物包埋法：将酶包埋在聚合物的凝胶格中的方法。最常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、明胶、海藻胶等，其中以聚丙烯酰胺凝胶为最好。制备时，在酶溶液中加入丙烯酰胺单体和交联剂N，N’-甲叉双丙酰胺，在通入氮气的条件下，加聚合反应催化剂四甲基二胺和聚合引发剂过硫酸钾等进行聚合，酶分子便被包埋在聚合的凝胶内。环境生物化学

酶固定化概念b微胶囊法：微胶囊法是以半透性的高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴。制备方法有3类：界面聚合法、液中干燥法和相分离法。环境生物化学

酶固定化概念界面聚合法是应用亲水性单体和疏水性单体在界面上发生聚合而将酶包围起来。液中干燥法是把酶液在含有高聚物的有机溶剂中进行乳化分散，然后再把该乳化液转移到水溶液中，使之干燥，形成高聚物半透膜而将酶分子包裹起来。相分离法是将聚合物溶解在不与水混溶的有机溶液中，然后将酶乳化分散在此溶液中，再在搅拌下徐徐加入引起相分离的非极性溶剂，聚合物的浓厚溶液将酶液包围，聚合物相继析出，形成半透膜，酶就被包裹在内。环境生物化学

酶固定化概念包埋法操作简便，酶分子仅仅是包埋起来而未起化学反应．可用来制备各种固定化酶，一般酶活力较高。但有时在化学聚合反应时，需要在比较苛刻的条件下进行，容易导致酶的失话，所以要设计好包埋条件。另外，此法对作用于大分子底物的酶类不适用。环境生物化学

酶固定化概念⑵固定化酶的性质游离酶在水溶液中，酶分子与底物分子同处于液相，几乎是十分邻近的。酶固定化后，酶分子牢固地结合于载体，处于与游离酶不同的微环境中，因此，固定化的结果往往引起酶性质的改变。原因主要来自两方面：一方面是酶本身的变化，主要由于活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；另一方面是载体的物理和化学性质的影响，主要由于在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体障碍的扩散层以及静电的相互作用等引起的。环境生物化学

酶固定化概念固定化酶性质的变化主要表现在以下几方面：①底物特异性的改变②最适pH的改变③最适温度的变化④动力学常数的变化⑤稳定性变化环境生物化学

酶固定化概念底物特异性的改变

同定化酶的活力一般比天然酶低，其底物特异性也可能发生变化。例如，用羧甲基纤维素作载体，肽法固定化的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的3％，而对低分子底物苯酰精氨酸—对-硝基酰替苯胺的活力保持100％。所以，一般认为酶被固定到载体后可引起立体障碍，使高分子底物与酶分子表面的邻近效应受到干扰，从而显著降低了酶的活性。而低分子底物则受到立体障碍的影响较小，底物分子容易接近酶分子，因而与原酶活力无显著差别。对以低分子物质为底物的酶，经固定化后，多数情况下底物特异性不发生变化。环境生物化学

酶固定化概念最适pH的改变由带负电载体制备的固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH高，而用带正电载体制备的则情况相反，而用不带电的载体，最适pH不变(但也有最适pH改变的例子)。这可能解释为：当酶分子被结合到带负电(或带正电)载体上时，酶蛋白的阳离子(或阴离子)数增多，从而造成固定化酶反应区域的pH值比外部溶液的pH值偏酸(或偏碱)，这样，造成酶的反应是在比反应液的pH偏酸(或偏碱)一侧进行的，从而使最适pH值转移到碱性(或酸性)一侧。最适pH改变而pH活性曲线的形状不变的现象，称为最适pH的平行移动。环境生物化学

酶固定化概念最适温度的变化酶固定化后，最适温度有时会发生变化。例如，以共价结合法固定化色氨酸酶的最适温度比固定化前高5-15℃，而以烷化法固定化氨基酰化酶的最适温度则比固定化前有所降低，多数情况下，最适温度并不发生变化。环境生物化学

酶固定化概念动力学常数的变化酶固定化于电中性载体后，固定化酶的表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小。具有与载体电荷相反的底物由于静电相吸，固定化酶与游离酶相比，表观米氏常数往往减小。若载体与底物有一方不带电，则往住表观米氏常数不变或稍有增加。表观米氏常数的减少，对固定化酶的实际应用是有利的，可使反应更为完全。环境生物化学

酶固定化概念稳定性变化酶固定化后，稳定性普遍增加，主要表现在对热的稳定性及贮藏的稳定性增加，且在蛋白质变性剂，如尿素、盐酸胍及有机溶剂中仍保持相当活性，对蛋白水解酶的抵抗性也增加等。这些特性都有利于酶的应用。环境生物化学

固定化酶反应动力学5.2.2固定化酶反应动力学酶经固定化后，其反应动力学发生显著的变化。固定化酶反应动力学较酶反应动力学复杂得多，影响因素也是多方面的，有些目前还处于研究探讨阶段。本节根据有关文献著作的报道，进行简要介绍。环境生物化学

固定化酶反应动力学⑴固定化对酶反应系统的影响通常，大多数酶在固定化后，反应速度有所下降（个别除外）。其原因如下：①酶构象改变：由于酶分子在固定化过程中发生了某种扭曲，影响了酶分子的三维结构，导致酶与底物结合能力或酶催化底物转化能力的改变。环境生物化学

固定化酶反应动力学②立体障碍：酶经固定化后，由于载体的存在，给酶的活性部位或调节部位造成了某种空间障碍，干扰与影响了酶与底物或其他效应物的接触。特别是当底物分子量较大时，影响就更大。③微扰效应：由于载体的疏水、亲水及荷电性质，使得紧邻固定化酶的环境区域（称微环境）发生变化，与宏观反应体系不同，对酶产生微扰效应，改变了酶的催化能力及酶对效应物作出调节反应的能力。环境生物化学

固定化酶反应动力学④分配效应：由于底物与其他各种效应物（包括H十与OH一）和载体间产生了静电、亲水或疏水之类的相互作用，造成了它们在载体内外侧浓度的不等分配，从而影响酶反应速度。⑤扩散限制：酶固定化后，底物、产物和其他效应物在载体内外之间的迁移扩散速度受到了某种限制，造成了不等分布。扩散限制与这些物质的分子量大小、载体的结构及酶反应性质有关。环境生物化学

固定化酶反应动力学扩散限制分为外扩散限制和内扩散限制。外扩散限制是指底物、产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散受到了限制，此限制主要存在于酶颗粒周围的处于层流状态的液膜（Nernst）层。内扩散限制是指在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散受到的限制。

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固定化酶反应动力学就外扩散限制来说，由于催化反应是在底物到酶活性部位以后才进行的，因此底物浓度在液膜层中的不等分布是线性梯度（产物浓度的不等分布也如此，但方向相反）。而就内扩散限制来说，由于催化反应与扩散过程几乎是同时进行的，所以底物在多孔载体内形成一种非线性梯度分布。

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固定化酶反应动力学以上各种原因是相互交叉、相互关联地存在着的，它们综合在一起决定着固定化酶的动力学性态。其中构象改变、立体障碍及微扰效应是直接影响酶的因素，这些因素对动力学的影响很难加以定量分析和概括，只能通过实验加以测定。它们的消除或改善只有依赖于选择合适的固定化条件、方法和载体。分配效应和扩散限制则是通过底物、产物和效应物在载体内外的不等分布来影响固定化酶的催化反应速度。环境生物化学

固定化酶反应动力学⑵固定化酶反应动力学假定酶被均匀地固定分布于载体内部，在稳定状态下进行不可逆的S→P的反应。反应时，外部的流动状况不影响载体内部，底物一边扩散，通过载体内的细孔，一边进行反应，底物在转移过程中将逐渐消耗。因此底物浓度的分布以及单位体积载体中酶反应速度也将随载体表面到载体内部的距离的增大而降低，且降低是非线性的。我们可用微分底物衡算导出其反应速度方程。环境生物化学

固定化酶反应动力学在微小体积内进行微分底物衡算。因为整个反应系统是处于稳定状态。所以，单位体积底物的改变速度νs`应该等于底物流入速度，即：5—1环境生物化学

固定化酶反应动力学其中，νs`为单位体积的底物改变速度，νsx

、νsy

、νsz为在x、y、Z轴方向上单位截面积的底物传递速度，称为通量。根据Fick定律，底物在x、y、Z轴上的通量为：5—2环境生物化学

固定化酶反应动力学D`s为载体内底物扩散系数，S`为载体内底物浓度。将式5-2代入式5-1得：5-3式5-3为直角座标系中的反应速度方程式。

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固定化酶反应动力学因为酶被均匀地固定在载体之中，而且，如果载体的形状为平板、圆柱、球状颗粒时，可分别取具有单体截面积的微小长方体、具有单位长度的微小圆环及微小球体来进行微分底物衡算（图5-4）。当只取x轴（即r方向）来表示时，上述方程式为：环境生物化学

固定化酶反应动力学图5-4载体的形状环境生物化学

固定化酶反应动力学

5-4G为形状因子，平板为1，圆柱为2，球状颗粒为3。

环境生物化学

固定化酶反应动力学式5-4为二阶常数微分方程式，为了获得非零解，就需要两个边界条件。第一个边界条件是在球体中心，即：这个条件下，在r=0处浓度分布可定义为对称，同时r=0又意味着没有扩散传递。5-5环境生物化学

固定化酶反应动力学第二边界条件是在载体的外表面r=R处。这时，还需考虑由于分配效应带来的载体和液体界面附近的S浓度分布不均匀。我们用分配系数Kp来表示靠界面内侧的底物浓度（S`i）和靠外侧的底物浓度〔Si〕之比，即：5-6环境生物化学

固定化酶反应动力学在这个边界上，进入载体表面的通量应该等于进入载体外界液膜层的通量，即：其中，kLS为传质系数，kLS=Ds/δ（Ds为底物在液体中扩散系数，δ为液膜层厚度）。

5-7环境生物化学

固定化酶反应动力学将式5-6代入式5-7得：5-9环境生物化学

固定化酶反应动力学为了便于讨论，进行无因次化并加以整理。无因次变量和无因次参数定义如下：

5-105-11环境生物化学

固定化酶反应动力学SA为无因次底物浓度。ρ为无因次距离。RS为当SA=1时，RS=1所确定的无因次反应速度方程式。Φ为Thiele模数，Bi为Biot准数（它反映了外扩散与内扩散的相对大小）。环境生物化学

固定化酶反应动力学根据式5-11的定义，基础方程式式5-4及两个边界条件式5-5,式5-9可表示为：Φ（—RS）

5-12环境生物化学

固定化酶反应动力学在稳定状态下，通过界面的底物全部发生反应，并以产物形式排出，所以，单位体积载体的总反应速度νp可用下式求得：平板:

圆柱:

球形:

5-135-14

5-15环境生物化学

固定化酶反应动力学因为不易获得载体内底物浓度，所以解式5-12没有什么意义。最好能只知道溶液中底物浓度[S]就可求出实际反应速度。因[S]可较容易定量测定。为了由[S]求出实际反应速度，需引入参数η（有效系数）。酶经固定化后，受载体的影响，其实际反应速度νp往往要比理论预期的反应速度低。通常用有效系数η来定量表示载体内部反应的有效程度。即：环境生物化学

固定化酶反应动力学νp表示单位体积固定化酶的实际反应速度。νS表示当载体内部浓度等于溶液中浓度时，单位体积固定化酶理论预期反应速度。

5-16环境生物化学

固定化酶反应动力学从这个定义出发，一般0＜η《l，但有时也可能出现η＞l的情况。有效系数η的重要性在于它可作为衡量固定化酶有效作用的尺度。因为只要知道溶液中底物浓度〔S〕，就可通过η来获得固定化酶的实际反应速度，而不需要去测定载体内的底物浓度S`。η还可以反应出分配效应及扩散限制效应对实际反应速度的影响程度。所以，只要求出固定化酶的η，即可据式5-16求得其实际反应速度。

环境生物化学

固定化酶反应动力学5-17（为了区别于游离的酶，我们把固定化酶的动力学参数都加“`”）。环境生物化学

固定化酶反应动力学根据式5-16，式5-13、5-14、5-15、式5-10、5-11及式4-4，可整理得到下式：

5-18因此，我们可通过上式先求出η，然后根据式6-17计算实际反应速度。环境生物化学

固定化酶反应动力学根据米氏方程：

5-19这时:

5-20环境生物化学

固定化酶反应动力学式中:

φ1代表速度常数为k`2[E`]／K`m时一级反应Thiele模数。因为式5-19为非线性方程，所以无法得到式5-12与解析解来求η,只能采用数值解。这时，η=f(φ1,k`,Bi,Kp,）。

5-21环境生物化学

固定化酶反应动力学当Bi→∞时，可应用下列模数φA计算η:

5-22为广义的Thiele模数，较小时（KP2=1,<0.3）环境生物化学

固定化酶反应动力学5-23较大时(=1,>2)

5-24当时,米氏方程为反应为一级环境生物化学

固定化酶反应动力学化学反应。当S`》K`m时，米氏方程为-νS`＝k`2[E`]，反应为零级化学反应。在这两种极端情况下，可以解式5-12得到其解析解，由此可求出η。其结果列入表5-1。当载体形状不同时，结果不一样。由表5-l和式5-17可求得各种形状固定化酶在一级、零级反应时的实际反应速度νp

。环境生物化学

固定化酶反应动力学平板(G=1)圆柱(G=2)

球(G=3)

一级反应

零级反应环境生物化学

固定化酶反应动力学**:、分别为零级、一级反应时的容器函数。***：较大时，

环境生物化学

固定化酶反应动力学****：式中：

环境生物化学

酶在污染治理中的应用5.2.3酶在污染治理中的应用酶在废水处理中的应用越来越受到重视，这是因为：①难降解有机污染物的排放日益增多，使用传统的化学和生物处理方法已很难达到令人满意的去除效果，这就需要找到一个比现行方法更快捷、更经济、更可靠、更简便的方法；②人们已逐渐认识到酶能用来专门处理某些特定的污染物；环境生物化学

酶在污染治理中的应用③生物工程技术的发展使酶的生产成本降低大多数废水处理过程可分为物理化学过程和生物处理过程。酶的处理介于二者之间，因为它所参与的化学反应是建立在生物催化剂作用的基础上的。环境生物化学

酶在污染治理中的应用与传统处理过程相比，酶处理有以下几个优点①能处理难以生物降解的化合物；②高浓度或低浓度废水都适用；③操作时的pH、温度和盐度的范围均很广；④不会因生物物质的聚集而减慢处理速度，处理过程的控制简便易行。环境生物化学

酶在污染治理中的应用⑴含酚废水处理芳香族化合物，包括酚和芳香胺，属于优先控制污染物（Prioritypollutant）。石油炼制厂、树脂和塑料生产厂、染料厂、织布厂等很多工业企业的废水中均含有此类物质。大多数芳香族化合物都有毒，在废水被排放前必须把它们去除。

环境生物化学

酶在污染治理中的应用很多酶已用于废水处理以取代传统的处理方法。其原因是：①酶具有高度选择性，能处理低浓度废水；②不易被有生物毒吐的物质所抑制；③相对于其他处理方法，酶可在较大污染浓度范围内发挥作用，而且所要求的停留时间也少。环境生物化学

酶在污染治理中的应用下面介绍几种具体的酶类及其应用①过氧化物酶（Peroxidase)由微生物或植物所产生的氧化还原酶。它们能催化很多反应，但都要求有过氧化物，如过氧化氧（H2O2）的存在来激活。过氧化氢首先氧化酶，然后酶才氧化底物。现在研究和应用较多的过氧化物酶有辣根过氧化物酶(horseracish

peroxidase,HRP）、木质素过氧化物酶（ligninperoxidase,IIP）及其他酶类。环境生物化学

酶在污染治理中的应用a辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRP,EC1.ll.1.7）是酶处理废水领域中应用最多的一种酶。有过氧化氢存在时，它能催化氧化很多种有毒的芳香族化合物，其中包括酚、苯胺、联苯胺及其相关的异构体。反应产物是不溶于水的沉淀物，这样就很容易用沉淀或过滤的方法将它们去除。

环境生物化学

酶在污染治理中的应用HRP特别适于废水处理还在于它能在一个较广的pH值和温度范围内保持活胜。HRP的很多应用都集中在含酚污染物的处理方面，使用HRP处理的污染物包括苯胺、羟基喹啉、致癌芳香族化合物（如联苯胺、萘胺）等。而且，HRP可以与一些难以去除的污染物一起沉淀，去除物形成多聚物而使难处理物质的去除效率增大。这个现象在处理含多种污染物的废水时有着重要的实际应用。环境生物化学

酶在污染治理中的应用提高酶的使用寿命和减少处理费用有以下几种方法：选择合适的反应器结构，将酶固定化，使用添加剂（如硼酸钾、明胶、聚乙二醇）防止酶被沉淀的多聚物带走，增加诸如滑石之类的吸收剂的量以防止酶被氧化产物抑制。环境生物化学

酶在污染治理中的应用b木质素过氧化物酶木质素过氧化物酶，也叫木质素酶（ligninase)，是Phanerochaete

chrysosporium

白腐真菌细胞酶系统的一部分。LIP可以处理很多难降解的芳香族化合物和氧化多种多环芳烃、酚类物质。LIP在木质素解聚中的作用已被证实。它的作用机理与HRP十分相似。LIP的稳定性是它在废水处理应用方面经济和技术可行险的关键因素。LIP在低pH值状态下被抑制。环境生物化学

酶在污染治理中的应用随着pH值的升高和在酒精存在清况下培养酶以提高酶的浓度，LIP的稳定新性也提高。去除酚类的优化条件是：酶的浓度高，pH值大于4.0，一定用量的过氧化氢。LIP固定在多孔陶瓷上并不影响它的活性，并表现出降解芳香族物质的良好性能。现在，一种能用于有害废物处理和生产LIP的硅膜反应器已研制出来。环境生物化学

酶在污染治理中的应用c植物来源的酶从西红柿中提取的过氧化物酶可用来使酚类化合物聚合。一些植物的根也可用于污染物的去除。植物过氧化物酶在处理2,4二氯酚浓度高达850mg/L的废水时，去除速率与纯的HRP差不多。去除速率与反应混合体系的pH值、植物原料颗粒大小、原料用量、是否有过氧化氢参与等因素有关环境生物化学

酶在污染治理中的应用②聚酚氧化酶（polyphenol

oxidascs)聚酚氧化酶代表另外一类催化酚类物质氧化的氧化还原酶。已们可分为两类：酪氨酸酶和漆酶。它们都需要氧气分子的参与，但不需要辅酶。环境生物化学

酶在污染治理中的应用a酪氨酸酶（tyrosinase)酪氨酸酶（EC1.14.18.1)，也叫酚酶或儿茶酚酶，催化两个连续的反应：(a）单分子酚与氧分子通过氧化还原反应形成邻苯二酚;(b）邻苯二酚脱氢形成苯醌，苯醌非常不稳定，通过非酶催化聚合反应形成不溶于水的产物，这样用简单的过滤即可去除。环境生物化学

酶在污染治理中的应用酪氨酸酶已成功地用于从工业废水中沉淀和去除浓度为0.01-1.0g/L的酚类。酪氨酸酶用甲壳素固定化后处理含酚废水，2h内去除率达100％。固定化酪氨酸酶可防止被水流冲走及与苯醌反应而失活。固定化酪氨酸酶使用10次后仍然有效。因此，固定酪氨酸酶于甲壳素上可有效去除有毒酚类物质。环境生物化学

酶在污染治理中的应用b漆酶（laccase)漆酶由一些真菌产生，通过聚合反应去除有毒酚类。而且，由于它的非选择性，能同时减少多种酚类的含量。事实上，漆酶能氧化酚类成十分活泼的相应阴离子自由基团。漆酶的去毒功能与被处理的特定物质、酶的来源及一些环境因素有关。环境生物化学

酶在污染治理中的应用⑵造纸废水处理①过氧化物酶和漆酶木材造纸工业纸浆中含有5-8g/100ml的木质残余物，使得纸浆呈褐色。现在的漂白剂是用氯气或二氧化氯。但漂白操作过程会产生黑褐色废水，包含有对环境有毒有害和致突变的氯化物。在经过使用微生物治理漂白废水后，现正积极考虑使用酶进行治理。辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶已应用于造纸废水脱色。环境生物化学

酶在污染治理中的应用它们的固定化形式的处理效果比游离形式好。LIP作用的机理为：通过将苯环单元催化氧化成能自动降解的阳离子基团而降解木质素。漆酶还可通过沉淀作用去除漂白废水中的氯酚和氯化木质素。

环境生物化学

酶在污染治理中的应用②分解纤维素的酶（cellulolyticenzymes)这类酶主要用于造纸浆和脱墨操作中的污染处理。纸浆和造纸操作中的废水处理产生的污泥纤维素含量高，可用于生产乙醇等能源物质。每生产1t纸大约产生60kg污泥，这样就可得到有经济价值的产品。环境生物化学

酶在污染治理中的应用使用的酶是由纤维二糖水合酶（EC3.2.1.91）、纤维素酶（EC3.2.1.14）和β-葡萄糖酶（EC3.2.1.21）组成的混合酶系。脱墨操作中产生的低含量纤维质废物可转化为可发酵的得糖类。所使用的酶在高浓度墨存在时不被抑制。

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酶在污染治理中的应用⑶含氰废水处理据估计全世界每年使用的氰化物为300万t，主要是在化学合成、人造织物、橡胶工业、制药工业、矿石浸取、煤处理、电镀等领域。而且，很多植物、微生物和昆虫也能分泌自己体内的氰化物。因为氰化物是新陈代谢抑制剂，对人类和其他生物有致命的危害，因此处理氰化物非常重要。环境生物化学

酶在污染治理中的应用①氰化物酶氰化物酶能把氰化物转变为氨和甲酸盐，因此是一步反应历程。Alcaligenes

denitnficans（一种革兰氏阴性菌）可产生氰化物酶，该酶有很强的亲和力和稳定性，且能处理浓度低于0.02mg/L的氰化物。环境生物化学

酶在污染治理中的应用氰化物酶的动力学性能服从米-门方程。氰化物酶的活性既不受废水中常见阳离子（如Fe2+、Zn2+和Ni2+）的影响，也不受诸如醋酸、甲酰胺、乙睛等有机物的影响。最适pH范围是7.8～8.3。适合于氰化物酶的反应器有扩散型平板膜反应器，它的优点在于防止酶被大分子冲刷和保护用来固定酶的基质不被破坏。氰化物通过半透膜与膜里面的酶反应，反应产物再渗透回溶液。环境生物化学

酶在污染治理中的应用②氰化物水合酶氰化物水合酶（EC4.2.1.66)，也叫甲酰胺水解酶，能水解氰化物成甲酸胺。这类酶可由很多种真菌获得，它们被固定后有更好的稳定性，更利于含氰废水的处理。环境生物化学

酶在污染治理中的应用⑷食品加工废水处理食品加工工业是工业废水的主要来源之一。其他工业废水大多是有毒的，必须转化为无毒物质，而食品工业废水易于分解或转化为饲料或其他有经济价值产品。酶可应用于食品工业废水处理，以净化废水并获得高附加值产品。环境生物化学

酶在污染治理中的应用①蛋白酶蛋白酶（Protease）是一类水解酶，在鱼肉加工工业废水处理中得到了广泛应用。蛋白酶能使废水中的蛋白质水解，得到可回收的溶液或有营养价值的饲料。蛋白酶水解蛋白质，首先被水中固体蛋白吸收，酶使蛋白质表面的多肽链解开，然后更紧密的内核才逐渐被水溶解。环境生物化学

酶在污染治理中的应用一种从Bacillussubtilis

中提取的碱胜酶（EC未知）可用于家禽屠宰场的羽毛处理。羽毛占家禽总重的5%，在其外表坚硬的角质素破坏后，是一种高蛋白的来源。通过NaOH预处理、机械破碎和酶的水解，可成为一种高蛋白含量的饲料成分环境生物化学

酶在污染治理中的应用②淀粉酶淀粉酶是一种多糖水解酶，多糖转变为单糖和发酵能同时进行，淀粉酶用于含淀粉废水处理，可使大米加工产生的废水中的有机物转化为酒精。淀粉酶还可减少活性污泥法处理废水的时间。环境生物化学

酶在污染治理中的应用淀粉酶和葡萄糖酶可用于光降解和生物降解塑料的生产。食品加工时产生的奶酪乳浆或土豆废水富含淀粉。首先使用a-淀粉酶，使淀粉由大分子化合物转变为小分子化合物，再用葡萄糖酶将其变成葡萄糖（多于90％的淀粉可转变为葡萄糖）。葡萄糖经乳酸菌发酵得到乳酸，用于生产可降解塑料。塑料的降解速度可通过乳酸与其他原料的比例来控制，一般是95％的乳酸和5％于环境无害的其他原料。环境生物化学

酶在污染治理中的应用⑸微生物脂酶的应用微生物脂酶（甘油脂水解酶，EC3.1.1.3）在现代生物技术中起着十分重要的作用并获得了广泛的应用。脂酶是生物体内脂类物质（三酰甘油脂）生物转化过程中不可缺少的催化剂。除其生物学意义外，脂酶在食品加工、生物医学、化工及环境保护等众多领域中有着巨大的应用前景。环境生物化学

酶在污染治理中的应用脂酶具有在液相和非液相（即有机相）界面间起催化作用的独特性能，使其与酯酶不同。脂酶界面激活的概念源自于以下事实，即脂酶的催化活性通常依赖于底物的聚集状态。可以认为，脂酶的激活涉及到酶的活性部位的暴露和结构变化，这种变化需要在有水包油液滴存在下通过构象的改变来实现。环境生物化学

酶在污染治理中的应用脂酶的活性与反应体系的表面积有关。最近对几种脂酶的结构研究结果为深人理解其水解活性、界面激活和立体选择性提供了一些思路。脂酶能催化一系列反应，包括水解、醇解、酸解、酯化和氨解等。环境生物化学

酶在污染治理中的应用尽管对脂酶的研究已有多年，且脂酶可利用微生物发酵大量获得，但脂酶的早期应用仅局限于油脂化学、乳品加工等行业。近年来，脂酶的应用领域不断拓宽，已涉及到制药、杀虫剂生产、单细胞蛋白生产、化妆品生产、废物处理及生物传感器等领域。环境生物化学

酶在污染治理中的应用脂酶广泛存在于自然界的动植物中，尤其在微生物体内，包括细菌、真菌在生物技术领域中，人们更多地关注利用微生物作为酶源的脂酶。大量的微生物可以用来生产脂酶，其中以假丝酵母（Candidasp.）、假单胞菌（Pseudomonassp.）和根霉（Rhizopussp.）为其重要的酶源。环境生物化学

酶在污染治理中的应用脂酶应用于被污染环境的生物修复以及废物处理是一个新兴的领域。石油开采和炼制过程中产生的油泄漏，脂加工过程中产生的含脂废物以及饮食业产生的废物，都可以用不同来源的脂酶进行有效的处理。例如，脂酶被广泛地用于废水处理。Dauber和Boehnke

研究出一种技术，利用酶的混合物，包括脂酶，将脱水污泥转化为沼气。环境生物化学

酶在污染治理中的应用一项日本专利报道了直接在废水中培养亲脂微生物来处理废水。脂酶的另一重要应用是降解聚酯产生有用物质，特别是用于生产非酯化的脂肪酸和内酯。脂酶在生物修复受污染环境中获得了广泛的应用。一项欧洲专利报道了利用脂酶抑制和去除冷却水系统中的生物膜沉积物。脂酶还用于制造液体肥皂，提高废脂肪的应用价值，净化工厂排放的废气，降解棕榈油生产废水中的污染物等。环境生物化学

酶在污染治理中的应用利用米曲霉（Asperillus

oryzae）产生的脂酶从废毛发生产胱氨酸，更加显示出了脂酶应用的诱人前景。利用亲脂微生物，特别是酵母菌，从工业废水生产单细胞蛋白，显示了脂酶在废物治理中应用的另一诱人前景。脂酶在环境污染物的治理中的应用总结于表5-2。环境生物化学

酶在污染治理中的应用脂酶来源处理对象脂酶来源处理对象米曲霉废毛发微生物脱水污泥假单胞菌石油污染土壤微生物聚合物废物假单胞菌有毒气体微生物废水米根酶棕榈油厂废物微生物废食用油酵母食品教工废水微生物生物膜沉积物表5-2脂酶在环境污染治理中的应用环境生物化学

酶在污染治理中的应用使用酶处理废水主要是通过沉淀或无害化去除污染物。酶也可用于废水预处理，使其在下一流程更易于去除。但是，在应用酶时，要特别注意处理过程中有无有毒物质的产生。因此，在应用酶进行具体实际操作前，一定要对酶反应是否可能产生有毒物进行充分研究。在酶处理过程中产生的固相沉淀物如酚类沉淀物要妥善处置。若用燃烧处理，则必须控制燃烧过程有害气体的产生。最好考虑沉淀物的综合利用。环境生物化学

酶在污染治理中的应用为了成功地应用酶处理工艺，必须考虑酶的费用。现在由于其分离、纯化和生产的费用，酶的价格仍较高高浓度污染物不利于使用酶处理，因为此时酶的用量多，处理费用太高。酶适于低浓度、高毒性污染物质的处理。环境生物化学

酶在污染治理中的应用来自于很多种植物的微生物酶在一系列的废水处理应用中发挥着重要的作用。酶能作用于特定的难降解污染物，通过沉淀或转化为无害物而把它们去除。它们也可改变特定废水的吐能使之更易于后续处理或有利于废物转化为有附加值的产品。环境生物化学

酶在污染治理中的应用酶处理有着广阔的应用前景。酶反应副产物的特性和稳定化、反应残余物的处理、处理费用问题必须进行深人研究。环境生物化学

5.3基因工程概述

5.3.1基因工程概述⑴基因工程的诞生 基因工程的诞生在理论上得益于三大发现：①Avevy(1934)等人的研究成果证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质，从而解决了遗传信息的来源问题；②Watson-Crick(1953)的双螺旋结构学说阐明了信息载体DNA的复制并解决了信息传递的方式问题;③Monod和Jacob（1961）提出操纵子学说，Nireberg(1966)等破译了遗传密码，叙述了“中心法则”，解决了遗传信息流向和表达的问题。环境生物化学

基因工程的诞生在技术理论上得益于三大发明：①Smith、Wilcox（1970）和Boyer（1972）等发现了限制性核酸内切酶和Khorana(1970)等发现了DNA连接酶，使DNA分子的切割和连接成为可能，从而为基因工程的技术操作奠定了良好的基础；②Lederberg(1946)发现细菌的F-性因子，以后相继发现和建立了其它外源基因运载体，Cohen（1973）首次将质粒作为基因工程的运载体使用；③Baltimore和Temin(1970)等人发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。环境生物化学

具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。1972年Berg(伯格)等人在世界上首次进行了DNA的体外重组，得到了包含SV40和λDNA的重组DNA分子。1973年Cohen(科恩)等人将编码卡那霉素的质粒DNA和编码四环素抗性的基因进行重组并转化大肠杆菌，结果转化菌同时表现出了卡那霉素和四环素的双重抗性，至此基因工程技术宣告诞生。随着分子生物学基础技术的发展，随后又出现了杂交技术、序列测定技术、PCR技术等一系列新技术，从而使基因工程技术日臻完善，环境生物化学

⑵基因工程的定义基因工程（Geneticengineering)是将不同生物的基因在体外人工剪切组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入适当的宿主细胞中进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。环境生物化学

目前基因工程的发展极为迅速，为生物学、医学、农学和环境科学等学科的理论研究及工业、农业和人类日常生活都带来了革命性的变化，其意义毫不逊色于有史以来任何一次技术革命，概括起来体现在以下三个方面：①用于大规模生产生物分子；②改造现有物种及设计构建新物种；③寻找、分离和鉴定生物体的遗传信息资源。环境生物化学

⑶基因工程的主要内容一个完整的体外DNA重组过程主要包括以下步骤；①获取目的基因并进行必要的改造；②选择合适的载体并加以适当的修饰;③将目的基因与载体连接，获得含有目的基因的重组载体；④将重组载体导入相应细胞(称为宿主细胞)并筛选出合重组DNA的细胞环境生物化学

DNA重组流程示意图环境生物化学

获得含有重组载体的细胞后，通过大量培养重组细胞，可以获得目的基因的大量拷贝或目的基因的表达产物。通常将来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物称为克隆，获取大量单一克隆的过程称为克隆化，也称无性繁殖。 广义的重组DNA技术不仅包括DNA体外重组技术及操作过程，还包括表达产物的后续处理过程和技术，如：蛋白质的分离纯化、环境生物化学

5.3.2目的基因的获得

(1)从基因组DNA中分离此法适用于结构简单的原核生物中的多拷贝基因，可直接从组织或供体中用理化方法或合适的限制性内切酶将DNA消化后分离获得。环境生物化学

①基因的随机断裂方法 采用一定的理化方法将基因组DNA随机断裂，可以得到大小基本一致的DNA片段。这些方法有用专一性核酸酶酶解，化学处理或普遍使用的机械切割法。DNA在溶液状态是呈细长线性分子，刚性强，在受到机械剪切作用时很容易断裂。用超声波处理DNA溶液，可得到平均长度在一定范围的DNA片段，使用组织捣碎，控制一定的条件，也可以使基因组DNA得到可控的剪切，如在1500rpm下，捣碎30min，可以得到平均大小为8kb的DNA片段。环境生物化学

②限制性内切酶降解一般多采用“鸟枪法”，即限制性内切酶部分酶解法。限制性内切酶降解所产生的片段的长短与其识别序列的长短直接相关。理论上讲，一个识别几个碱基的限制酶位点在基因组的分布几率为1/4n(n为限制性内切酶所识别的特异序列中的核苷酸个数)，因此采用基因组DNA进行限制酶的不完全酶解，可以得到长短不一的片段，用于构建基因文库。环境生物化学

⑵基因的化学合成法化学合成法是利用自动DNA合成仪直接合成基因序列的方法，适合于长度较短的基因，其前提条件是:该基因的核苷酸序列已知。对于较大的基因，可以分段合成DNA短片段，再经过DNA连接酶作用依次连接成一个完整的基因链。环境生物化学

目前核酸的合成方法中，固相合成法是最为常用的。其原理是：首先将寡核昔酸链3′末端的第1个核苷酸先固定在一个不溶性的高分子(例硅胶微粒)上；然后，从此末端开始逐一加上脱氧核苷酸以延长DNA链，每延长1个核苷酸经历1个循环，合成的核苷酸被固定在固相载体上，而过量的未接上的反应物或分解物则经过过滤或洗涤除去；至合成所需的长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上洗脱，经分离纯化后得到所需的最后产物。环境生物化学

⑶通过RNA合成cDNA以从细胞中提取的mRNA为模扳，借逆转录酶反转录生成cDNA，然后进行基因克隆，从而获得某种特定基因。合成cDNA技术的应用不仅依赖于分离得到相当纯的mRNA，而且还取决于mRNA的含量。如果—种mRNA在总则RNA中的含量高，就比较容易提取纯化。反之如果—种mRNA在总则RNA中的含量低，直接获得就相当困难。环境生物化学

c-DNA合成原理示意图环境生物化学

⑷用聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的基因片段聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction,PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。它的基本原理是以分别位于待扩增DNA区段两侧的两段序列互不相同并分别与模板DNA两条链上的各一段互补的寡核苷酸为引物。环境生物化学

反应分三步：①变性(denaturation)-通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火(annealling)-随之将反应混合液突然冷却至某一温度，反应体系中摩尔数大大过量的引物DNA可与其互补的模板在局部形成杂交链；③延伸(extension)-在DNA聚合酶、4种dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物为起始点的5’→3’的DNA链延伸反应。环境生物化学

聚合酶链式反应示意图环境生物化学

利用PCR技术可以直接从染色体DNA或cDNA快速简便地获得待克隆的目的基因片段，快速地进行外源基因的克隆操作。PCR技术扩增目的基因的前提是必须知道目的基因片段两侧或附近的DNA序列，并据此合成扩增引物。由PCR体外扩增的片段可经克隆作进一步分析用，也可直接纯化作各种探针用。该法也解决了微量基因片段的来源问题。环境生物化学

⑸基因文库与cDNA文库的构建

大部分未知基因不能用上述方法获得，需要先构建文库，再经筛选获得目的基因。文库分为基因文库和cDNA文库两种。环境生物化学

基因文库(genomiclibrary)是指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体。构建基因组文库时，先将细胞染色体DNA提纯，用限制性内切酶将染色体DNA切割成大小不等的许多片段，与同一类载体拼接，继而转入受体菌扩增，这样就构建了含有多个克隆的基因组DNA文库。基因组DNA文库理论上可以涵盖基因组的全部基因信息。环境生物化学

如果以细胞总mRNA为模板，经反转录生成互补DNA(cDNA)，酶切后的DNA片段与合适的载体连接，转入受体菌，这样建立的就是cDNA文库(cDNAlibrary)。cDNA文库理论上包含了细胞全部mRNA信息，可以利用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA，这是获取结构基因的主要方法。环境生物化学

基因文库与cDNA文库的构建步骤环境生物化学

5.3.3基因工程载体

载体是指可以携带目的基因进入宿主细胞的运载工具。基因工程的载体应该符合以下条件：①具有自主复制能力，能带动外原基因在宿主细胞内复制和扩增；②具有较多的拷贝数，易于分离提纯：⑨分子质量相对较小，便于操作，并有足够的接纳目的基因的容量；④有供外原基因插入的多个单一限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点(MCS)，用于目的基因的克隆；⑥有一个或多个筛选标记(如：对抗菌素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等)。环境生物化学

按照来源不同，可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等类型；按照用途不同，可将载体分为克隆载体和表达载体。以下简要介绍几类常用的载体。环境生物化学

⑴质粒载体

质粒是某些细胞中独立于染色体以外的共价闭环的小分子双链DNA，它具有独立的复制能力，并可在细胞分裂中与染色体一道分配到子细胞中。不同质粒的分子质量大小不同，大的可达数百千碱基对(kb)，小的只有2—3kb。在革兰氏阴性和阳性细菌、酵母菌以及其他一些真菌中都发现有质粒的存在。此外，质粒往往携带一些抗性基因，这为重组子的选择提供极大便利。环境生物化学

早期以天然质粒作为裁体，现在使用的均为改造过的人工质粒，常用的有：pBR322、pUC及pGEM等多种系列的质粒载体。质粒载体不仅可以用于细菌，也可以用于酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等，既可用于目的基因的克隆，也可用于目的基因的表达。环境生物化学

pBR322是经典质粒的代表，它是由3个天然质粒的不同部分拼接而成，全长4.36kb，是环状双链DNA分子。在细菌中的拷贝数多，便于制备：有多克隆位点，用于插入外源DNA片段;有四环素(TcR)和氨苄青霉素(ApR)两个抗药性基因标记，缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322质粒转化后便从其获得了抗生素抗性。两个抗生素抗性基因中均含有外源DNA克隆位点，插入外源DNA后，相应抗性基因即失活。环境生物化学

质粒pBR322的结构图环境生物化学

⑵λ噬菌体载体λ噬菌体的生活周期包括溶菌周期和溶原周期：当λ噬菌体侵入大肠杆菌后，可以在细菌内扩增，并使细胞裂解，释放出大量的噬菌体颗粒；也可通过溶原途径，使其DNA整合到大肠杆菌的染色体上，以前噬菌体的形式潜伏下来。在某些特定条件下，整合的λ噬菌体被切割下来，进入裂解周期环境生物化学

λ噬菌体感染途径环境生物化学

λ噬菌体的基因组DNA长约48kb，在宿主体外与蛋白质结合包装为含有双链线状DNA分子的颗粒。由于受到包装效率的限制，其连接目的基因后的总长度应为λ噬菌体基因组总长度的75％一105％，超过这一范围，重组噬菌体的活力会大大降低。环境生物化学

根据克隆的方式不同，λ噬菌体载体可以分为插入型载体和取代(置换)型载体两类：插入型载体适合克隆6-8kb大小的DNA片段，常用于cDNA的克隆或cDNA文库的构建，如：λgt10、λgtll等；置换型载体可以允许插入长度达30kb的外派DNA片段，因而适用于基因组DNA的克隆及基因组DNA文库和cDNA文库的构建，典型代表为EMBL系列和Charon系列载体。环境生物化学

⑶黏性质粒与人工染色体

黏性质粒(Cosmid)又叫柯斯质粒，它是由质粒和λ噬菌体的cos黏性末端构建而成的载体系列。黏粒大小为4—6kb，兼有λ噬菌体和质粒两方面的优点，可以克隆31—45kb的外源DNA片段，而且能被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。黏粒主要用于真核细胞基因组文库的构建。环境生物化学

人工染色体是为了克隆更大的DNA片段而发展起来的新型载体，其中YAC(酵母人工染色体)是在酵母细胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆载体。YAC可以接受100—2000kb的外源DNA的插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。另外还有BAC(细菌人工染色体)以及目前正在发展的MAC(哺乳动物人工染色体)，这些载体在人类基因组计划和其他基因组项目中起到了关键性作用。环境生物化学

上述载体主要为克隆载体，用于目的基因的克隆、扩增、序列分析及体外定点突变等。为了在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物而应用的载体被称为表达载体。表达载体除了含有克隆载体中的主要元件外，还含有表达目的基因所需要的各种元件环境生物化学

5.3.4基因工程工具酶

⑴限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶，简称为限制酶，是能够识别和切割双链DNA中特定核苷酸序列的一类核酸酶。限制性内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制—修饰体系，其功能为限制(切割)外源DNA和保护自身DNA，维持细菌自身遗传性状的稳定。环境生物化学

限制性核酸内切酶，按照其对辅助因子的需求和切割双链DNA的特性，可以分为I、Ⅱ和Ⅲ型，三种不同的限制性核酸内切酶具有不同的特性环境生物化学

基因工程技术中所用的主要是Ⅱ型限制性内切酶，其特点为：识别与切割特定的核苷酸序列，因而产生特异性切口。Ⅱ型限制性内切酶的识别序列常为4—6个核苷酸的回文结构，即同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链。限制性内切酶消化后的DNA可以形成没有单链突出的末端，称为平端或钝端，如：SmaⅠ；也可以形成有单链突出的所谓黏性末端。黏性末端中有5＇＇突出的黏性末端，如：BamHⅠ;也有3＇突出的黏性末端环境生物化学

限定性内切酶切割DNA产生的DNA片段末端环境生物化学

⑵DNA聚合酶

DNA聚合酶催化以DNA为模板合成DNA的反应，在基因工程技术中用于DNA的体外合成。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KIenow酶)、T4DNA聚合酶及耐高温DNA聚合酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是，它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3＇-羟基末端上。环境生物化学

该酶具有3种活性：5＇→3＇聚合酶活性、5＇→3＇外切酶活性及3＇→5＇外切酶活性。它在分子克隆中主要用于制备供核酸分子杂交用的放射性同位素标记的DNA探针。

①大肠杆菌DNA聚合酶I环境生物化学

它是由大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)经枯草杆菌蛋白酶处理后产生出来的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，但是失去了5＇→3＇外切酶活性，主要用于填补经限制酶消化所形成的DNA3＇-末端、合成cDNA的第二链及DNA序列的测定。②K1enow聚合酶

环境生物化学

③热稳定DNA聚合酶

aqDNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子质量为65ku，最佳反应温度为70℃。TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链反应(pCR)。环境生物化学

④反转录酶

反转录酶又称逆转录酶，是一类特殊的DNA聚合酶，它以RNA为模板，合成DNA。它具有5＇→3＇聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性。目前，已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，但最普便使用的则是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)中的反转录酶。在体外以mRNA模扳合成cDNA，是反转录酶的最主要用途。环境生物化学

⑶DNA连接酶DNA连接酶有两种，一种是T4DNA连接酶(T4DNALigase)，是从噬菌体T4感染的大肠杆菌中分离纯化获得的。另一种是大扬杆菌DNA连接酶(E.coliDNALigase)，是直接从大肠杆菌中分离纯化的连接酶。这两种连接酶催化连接反应的机制是类似的，都能把双链DNA中1条单链上相邻两核苷酸断开的磷酸二酯键(称之为切口)重新闭合。环境生物化学

两种连接酶催化的反应过程，在两个方面有不同，一方面是T4DNA连接酶可以催化平头末端的双链DNA链间的连接，也能催化粘性末端的双链DNA的连接。而大肠杆菌DNA连接酶对平头末端的双链DNA连接的催化效率极低，因此它一般使用于粘性末端连接。另一方面是，T4DNA连接酶催化的反应需要能量因子ATP参与，而大肠杆菌DNA连接酶需NAD辅因子。所以，T4DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更为常用。环境生物化学

⑷其他DNA修饰酶基因工程技术除了上述3类主要的工具酶外，还可以利用一些其他的酶，如：末端脱氧核苷酸转移酶可以催化一种或多种核苷酸连接到DNA片段的3＇-羟基末端形成同聚尾；碱性磷酸酶能特异地切除DNA或RNA的5＇-末端的磷酸基团，防止自身环化；核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)在重组DNA技术中用于消化去除RNA或DNA的污染。环境生物化学

2.3.5重组体的构建

⑴相同酶切位点的连接如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的黏性末端在降低温度(退火)时，能重新配对，在DNA连接酶的催化下，形成3＇，5＇－磷酸二酯链，将两端点连接起来，构成重组体分子环境生物化学

同一限制酶切割DNA新性末端的连接环境生物化学

⑵不同限制酶产生相同黏性末端的连接不同的限制性核酸内切酶消化，如果产生的DNA的黏性末端相同，也同样可用上述方法连接，如：上述识别6bp序列的BamHI和另一识别4bp序列的Sau3AI，切割DNA后都产生5-突出黏性末端GATC，可以互补结合连接环境生物化学

不同限制酶产生相同黏性末端的连接环境生物化学

⑶平末端连接T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的黏性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA连接酶连接，但平末端连接要比黏性末端连接的效率低得多。环境生物化学

⑷同聚物加尾连接

如果要连接的两个DNA片段没有能互补的黏性末端，可用末端转移酶催化，在DNA的3＇－末端添加一段同聚物序列，例如:一段DNA加上polyG，另一段DNA(载体)加上polyC，这样人工地在DNA两端制造出能互补的共核苷酸多聚物黏性末端，退火后能结合连接，这种方法称为同聚物加层法。环境生物化学

⑸人工接头连接

对平末端的DNA或载体DNA，也可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制内切酶位点，经内切酶切