2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的分子机制研究

2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的分子机制研究

2型糖尿病（t2sd），即非胰岛素依赖于糖尿病的特点。它以胰岛素抵抗、胰岛素敏感性降低和糖代谢紊乱为特征。随着中国社会老龄化和高糖高脂肪生活习性的改善，t2dm逐年增加，给家庭和社会带来了巨大的经济负担，已成为中国必须解决的社会问题。目前，我国尚未有效的防病毒药物仍缺乏，其发病机制尚不清楚。许多研究人员使用不同的动物模型来研究t2d的发病机制，其中高脂肪糖饲料（hfd）和链-行李菌素（stz）主要用于腹腔注射诱导t2d模型。虽然较少的研究对肝组织中氨酸（酶）含量的变化缺乏全面的系统研究。通过高脂肪高胆固醇、低糖饮食指南（stz）和低剂量瘦素（酶）的选择性破坏肝组织细胞，建立二维模型，检测肝组织的生物化学（ros）和内源性脲醇（酶）的含量，探讨肝组织的氧化反应与胰岛素抵抗之间的关系，为探索t2d的发病机制提供新的思路。1数据和方法1.1氧化氮、丙二醛、丙二醛、谷胱甘肽、glutshSTZ由美国Sigma公司提供.一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)、诱导型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS),一氧化氮(nitricoxide,NO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase,GR)、总抗氧化能力(totalantioxidativecapacity,T-AOC)和总超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutases,T-SOD)试剂盒为南京建城生物试剂公司生产.1.2灌胃乳剂制备胆固醇清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只,6周龄,体重(200±10)g,购自昆明医学院实验动物中心,动物生产许可证号:SCKK(滇)2005-0008,室温(20±2)℃,自然光照,自由进水进食,随机分为正常对照组(20只),高脂高胆固醇灌胃加糖水喂养组(HFD组,40只).正常对照组喂以普通饮食,HFD组以高脂高胆固醇灌胃加糖水喂养诱发胰岛素抵抗(insulinresistance,IR):高脂高胆固醇灌胃乳剂配制(把250mL猪油水浴加热至98℃后,加入5g已经充分研磨成粉末状的胆固醇,混合后再在高温98℃水浴中充分混合均匀形成胆固醇脂肪混悬液:脂肪98%,胆固醇2%);以高脂高胆固醇灌胃(2次/d、5mL/次),饮水(10%蔗糖).灌胃3个月后,用口服葡萄糖耐量实验(oralglucosetolerancetest,OGTT)检测两组大鼠胰岛素的抵抗性,并检测血清糖化血清蛋白(FMN)、甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(totalcholesterol,TCHOL)、超敏C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)、血糖(GLU)、C肽(C-peptide,C-P)和血胰岛素(insulin,INS).然后将HFD组腹腔内注射STZ,即高脂高胆固醇灌胃、糖水喂养加STZ注射组(STZ+HFD组):腹腔内注射STZ(20mg/kg),3d后再注射1次(STZ,20mg/kg),选择性摧毁胰岛细胞诱发高血糖症.继续喂以高脂(普通饲料在液态50℃猪油中浸泡1min)、高胆固醇(占猪油的1%)、高糖(糖水5%)2月.检测血清FMN、TG、TCHOL、CRP、GLU、C-P、INS和肝组织中NOS、iNOS,NO、MDA、GSH、GR、T-AOC、T-SOD的含量.1.3检测方法1.3.1眼内瞳静脉血清学检测血标本采集时间通常在上午10点钟以后,3.6%水合氯醛麻醉下(1mL/100g)眼内眦静脉取血,GLU于3h内检测,而FMN、TG、TCHOL、CRP、C—P和INS在2h内先于2000rpm离心10min取出血清,置于-40℃冰箱中保存后自动生化仪上进行检测.1.3.2glu、inf-l-4检测glu和inf大鼠夜间空腹10~12h,内眦静脉取血(2mL)后,给予葡萄糖2g/kg灌胃,2h后内眦静脉取血,分别测GLU及INS.由于大鼠血量有限,每次采血3mL,OGTT只检测0min和2h.1.3.3胰岛素抵抗按HOMA模型计算胰岛素抵抗指数(insulinresistanceindex,IRI):以此反映研究对象的胰岛素抵抗程度.1.3.4相关蛋白测定STZ+HFD组高脂高糖喂养2月后,将大鼠麻醉,快速断头,取出肝组织,称重,用生理盐水制成10%的组织匀浆,离心,取上清液用相关试剂盒测定NO、SOD、GR、GSH、MDA、TNOS、iNOS和T-AOC.考马斯亮蓝法测定蛋白含量(严格按照测定试剂盒测定试剂盒说明书上提供比色法测定).1.4方差齐性检验、正交试验所有数据采用SPSS软件进行统计分析,计量资料数据经正态检验均为正态分布(P>0.05),经方差齐性检验方差齐(P>0.05),采用单因素方差分析,用LSD、q检验,进行组间两两比较.2结果2.1体重增长率1~2月,HFD组体重增长速度较对照组慢,3个月后体重增长速度开始变快,4~5月时体重增长速度明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图1.2.22d模型中大鼠糖代谢变化及相关生化指标的变化2.3t-aaoc、t-sod检测T2DM模型大鼠肝组织中TNOS、iNOS、MDA和GR的含量明显高于对照组(P<0.05);NO、GSH较正常对照组显著降低(P<0.05),T-AOC、T-SOD无明显差异(P>0.05),见表4~5.与对照组比较,*P<0.05;与HFD组比较,△P<0.05.3对大鼠血糖和胰腺代谢性的影响探究IR的机制、寻找治疗T2DM的方法一直是人类科学研究的重要内容之一,虽然临床上对于T2DM的病因和发病机制尚不完全清楚,但国内外学者已建立了多种拟T2DM动物模型,如:肥胖型的T2DM动物模型、药物(STZ)诱导的T2DM动物模型和高脂高糖喂养+药物诱导T2DM动物模型.但每种模型均有一定的局限性,不能全面模拟出人类T2DM的特征.肥胖型的T2DM动物模型遗传因素起主导作用,肥胖及高血糖等症状是先天性的,出生便存在,而成人普通T2DM患者,虽然有遗传易感性,但青少年时期并没有糖尿病症状,甚至糖耐量也无异常,成年以后在各种环境因素的作用下(超重或肥胖)才发生糖尿病,超重或肥胖在成人普通T2DM发生过程中起到至关重要的作用.STZ诱导的T2DM大鼠模型,无论是大剂量还是小剂量,从体重上来看,都属于非肥胖型,而且STZ用量越大,胰岛破坏越严重,越趋向于1型糖尿病.而高脂高糖灌胃+STZ腹腔注射诱导T2DM大鼠模型具有肥胖、葡萄糖和脂质代谢紊乱,同时具有高胰岛素血症和胰岛素抵抗的特征,非常类似成人普通T2DM,且造模经济、简单,故目前广泛应用于T2DM试验研究.本研究发现:高脂高胆固醇灌胃加糖水喂养3月后,HFD组FMN、TG、TCHOL、CRP、C-P、INS和IRI明显高于对照组,而空腹GLU没有变化(见表1~3),出现了高甘油三酯、高胰岛素血症和IR.继而腹腔注射低剂量的STZ打击胰腺功能,导致STZ+HD组FMN、TG、TCHOL、CRP、C-P、FGLU、INS和IRI明显高于HFD组和对照组(见表1~3),诱发出明显的高甘油三酯、高胰岛素血症和IR,且进一步胰腺代偿性分泌INS的功能障碍,从而诱发出高血糖症.笔者还发现在造模过程中,由于长期灌喂对食道的损伤,1~2月模型组动物体重增长速度较对照组慢.3个月后灌胃技术逐渐成熟,大鼠逐渐适应,体重增长速度开始变快,4~5月时体重增长速度明显高于对照组.目前在T2DM研究中,主要着眼于对ROS、炎性因子与胰腺细胞凋亡的探索,且越来越多的研究证明:活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)直接参与了T2DM、高血压、冠心病、老年痴呆、骨质疏松等多种老年相关性疾病的病理过程.而对内源性抗氧化剂,特别是巯醇抗氧化剂(酶)的调控作用未见系统报道.生物体内存在一个有效抵抗ROS的抗氧化剂(Antioxidants)防御系统.其中巯醇抗氧化剂(酶)是哺乳动物细胞内分布最广、最重要的内源性抗氧化系统,也是细胞内自由基的主要捕获剂(Scavenger)和细胞功能与活力的指示剂.它主要包括GSH合成与代谢调节的相关酶如:GR、Gpx等.本研究发现:T2DM模型大鼠肝组织中MDA和GR的含量明显高于对照组,GSH的含量明显低于对照组,而T-AOC、T-SOD无明显差异(见表4~5).说明HFD+STZ能通过诱导ROS的产生和调控内源性巯醇抗氧化剂(酶)GSH,从而诱发高脂血症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和高糖血症.而GSH的大量消耗,诱导了肝组织代偿性的分泌GR.近年来,NO及其合成酶(NOS)在T2DM、高血压、冠心病、老年痴呆等疾病中的作用越来越受到人们的重视,NO是神经元和内皮细胞在NOS的作用下,催化左旋精胺酸和氧合成的信号分子.而N0S是内源性NO合成的主要限速酶,分3种亚型即神经型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)、诱生NOS(iNOS).日前,NO、NOS及其3种亚型在T2MD中的作用仍一直存在争论,有研究表明它们能诱发一氧化氮氧化应激(Nitroxidativestress),启动一系列的氧化反应,而诱发IR.同时有文献提出相反的观点,认为NO在糖尿病早期具有对抗炎症和高血压的作用,其机制可能涉及抑制神经细胞凋亡和调控ROS、炎性因子的表达.本研究发现:T2DM模型大鼠肝组织中TNOS和INOS的含量明显高于对照组,而NO的含量明显低于对照组.说明NO是在T2DM中具有保护作用,大量NO的消耗,诱发了NOS的代偿性分泌(以iNOS为主).HFD+STZ能诱发ROS的产生和调控内源性NO的含量,从而诱发高脂血症、高胰岛