不同环节干片对免疫组化染色的影响

不同环节干片对免疫组化染色的影响

免疫组染色是病理诊断中非常重要的一种非常重要的辅助诊断方法，也是许多科学研究项目中应使用的基本实验方法。此染色方法步骤较多,对染色结果的影响因素也较多,因此我们必须严格按照操作规范来进行操作,以提供可靠的实验结果。在实际操作中,老一辈的免疫组化工作者总是提醒我们不要“干片”。所谓“干片”,就是指在整个免疫组化染色过程中组织上覆盖的液体(抗体、显色液、蒸馏水、PBS(磷酸盐缓冲液)等)由于挥发或在液体表面张力的作用下收缩,导致组织直接裸露在空气中的情况,还有就是热修复时修复液过少造成组织浸泡不到。干片会造成何种影响呢?下面我们以目前比较常用的非生物素试剂盒“Elivision-plus法”中的操作步骤进行说明。先列出此方法具体步骤:(1)石蜡切片脱蜡和水化后,用PBS(pH7.4)冲洗3次,每次3分钟;(2)根据一抗的要求,对组织抗原进行微波修复、胃酶修复或EDTA修复,蒸馏水洗一次,再用PBS冲洗3次,每次3分钟;(3)每滴切片加50μ3%过氧化氢溶液,室温下孵育10分钟,PBS冲洗3次,每次3分钟;(4)甩去PBS,每张切片加约50μl第一抗体,室温下孵育60分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟;(5)甩去PBS,每张切片加约50μl聚合物增强剂,室温下孵育20分钟,PBS冲洗3次,每次3分钟;(6)甩去PBS,每张切片加约50μl酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育30分钟,PBS冲洗3次,每次3分钟;(7)甩去PBS,每张切片加约100μl新鲜配置的DAB显色液,显微镜下观察3~10分钟,阳性显色为棕色;(8)蒸馏水冲洗,再自来水冲洗,苏木素复染2分钟,1%盐酸酒精分化3秒,自来水冲洗15分钟返蓝;(9)由低到高梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。由以上步骤可以看出,免疫组化全程几乎都与液体打交道。理想状态下,组织片始终是处于一种湿润状态的,而为了保证组织湿润,我们会把组织片放在“湿盒”中进行孵育。在实际操作中,会有很多环节可能导致干片,具体分为几种情况:一是修复时修复液过少造成组织浸泡不全;二是冲洗时放置时间过长或冲洗液过少造成干片;三是滴加试剂时忘记滴加或试剂不够或滴加后忘记盖上湿盒的盖子造成干片。全程滴加的试剂分别是双氧水(10min)、一抗(60min或室温过中午或4℃过夜)、增强剂(20min)、聚合物(30min)、DAB显色液(3~10min)、苏木素(2min)。其中一抗是最重要也是孵育时间最长的一个环节,如发生干片影响也最大。其余试剂大都孵育时间较短,只要滴加试剂量足够,即便未放入湿盒也相对不易干片。因此我们在这一环节就选用一抗作为代表来研究干片造成的影响。1材料和方法1.1微波型抗体(1)随机抽取本科室30例乳腺癌标本,每例各切4张切片,分为4组。(2)福州迈新生物技术开发有限公司提供的ER浓缩型抗体,产品编号:RMA-0501,克隆号:SP1,预处理:高温修复(柠檬酸),阳性部位:胞核。(3)家用750W格兰仕微波炉一台;(4)福州迈新公司提供的Elivision-plus试剂盒;(5)柠檬酸盐抗原修复缓冲液(粉剂)(0.01M,pH6.0);(6)福州迈新公司提供的DAB试剂盒,DAB-0031;(7)酒精、二甲苯;苏木素。1.2方法1.2.1第二组在修复时加入不足够的修复液,及时对切片的干片第一组为对照组,按Elivision-plus正常步骤操作;第二组在修复时加入不足够的修复液,人为造成干片;第三组在修复后直接将切片在空气中晾干,人为造成干片;第四组在滴加一抗后并不盖上湿盒的盖子,造成干片。其余操作完全同第一组。1.2.2采用统计软件spss130，卡方验证2干片对免疫组化的影响显微镜镜下阅片,ER在乳腺癌细胞胞核呈现较均匀棕褐色着色。在胞核以外的部位出现类似深浅不一的棕褐色着色即为背景。阳性染色强度按照以下标准:无阳性染色为-;弱阳性染色为+,较强阳性染色为++;最强阳性染色为+++。背景染色强度按照以下标准:无背景染色为-;背景染色与弱阳性染色相当为+;背景染色与较强阳性染色相当为++。当修复液不足时,主要影响阳性表达。淹没部分基本不影响,而未淹没部分则造成干片,全部为阴性,分界明显;但背景依然清晰,未受影响。修复后晾干与正常步骤操作的结果无统计学差异(P>0.05),对染色结果无影响。滴加一抗后如果干片,对染色结果影响很大(与正常操作步骤比较P<0.01)。本次试验虽然基本上也都有表达,但总体偏弱,而且表达不均匀。少数地方强,但大部分地方弱,某些局部甚至阴性。对背景影响尤为明显,整张片子显得比较黄而且不太透明,边缘效应也较常见。干片对免疫组化不同环节影响的情况见表1。染色结果如图1~4所示。3免疫组化干片的修复和滴加抗体本次实验之所以选择ER,是因为它是临床诊断最常应用的抗体之一,是很成熟、表达很稳定的抗体。它的表达部位在胞核,十分有利于观察,也有利于区别背景着色。“不要干片”是免疫组化操作中的一个原则,但大多书籍、文献报道比较笼统,缺乏细致的比较以区别对待。之所以要研究不同环节干片所造成的影响,就是想探索干片造成影响的原理,以方便我们更加正确和便捷地处理免疫组化操作。实验已证明,在修复环节,是绝对不能干片的,因为这会导致假阴性。修复液的pH值对修复效果影响显著,未浸泡到部分虽然能达到相应温度,但无法满足其要求的pH值环境。“修复后晾干”代表各个冲洗环节,包括自来水洗、蒸馏水洗、PBS洗等。这些环节原本也不容易发生干片,只是在修复后滴加抗体前要先给玻片“画圈”(即将组织周围的水分擦干,然后用PAP笔(免疫组化笔)在组织周围1~2mm的玻片上画一个完整的圈,以防止滴加试剂后试剂向周围流失),在这个过程中组织往往会部分干片。许多人担心这会造成背景,其实大可不必担心,事实证明此阶段的干片对染色结果基本无影响。那么,我们以后在画圈时也不必再要求“迅速、麻利”了。滴加抗体后,在张力作用下,抗体有向中间收缩的趋势,加上试剂的边缘挥发较快,水分挥发后,组织边缘的抗体浓度实际上是增高了,因此染色会偏深,也容易出现非特异着色;如果边缘挥发明显,则会造成干片,可出现假阳性及很深的背景。在湿盒中由于湿度很大,基本能抑制液体挥发。一抗作用时间长,如果干片,局部试剂能