香蕉皮中单宁的提取及抑菌活性研究

香蕉皮中单宁的提取及抑菌活性研究

香蕉是香蕉科的一种典型的热带作物，具有丰富的营养。然而，作为一种极其丰富的垃圾资源，香香蕉皮尚未得到有效开发和利用。单宁又称鞣质,广泛存在于植物体的叶、壳、果肉以及树皮中。不同原料中的单宁,在化学结构上有很大的差异,性质也不完全相同;但他们都是多元酚类的衍生物,单宁所具有的多种生理活性,如止血、抑菌、抗过敏、抗突变、抗癌、抗衰老、抗肿瘤等,正是这些基本化学性质的综合体现。有关于香蕉皮中单宁的提取及抑菌方面的研究尚不多见。本研究利用正交试验方法对香蕉皮中单宁的最佳提取工艺进行了优化,并对其抗菌特性进行了初探,与常用食品防腐剂山梨酸钾的抑菌效果进行对比,以探讨香蕉皮单宁作为食品天然防腐剂的应用前景,并为单宁作为天然抑菌剂提供理论依据,同时为香蕉皮的综合利用开辟一条新途径。1材料和方法1.1供试菌种及培养基材料:不同成熟度的市售鲜香蕉(品种:芝麻蕉,产地:海南)。未成熟香蕉皮用青香蕉皮表示,成熟香蕉皮用黄香蕉皮表示,过熟香蕉皮用黑香蕉皮表示。药品:丙酮、磷钼酸、钨酸钠、磷酸、单宁酸等,均为分析纯试剂。供试菌种:细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);霉菌为黑曲霉(Aspergillusniger)、黄曲霉(Aspergilusflaus);酵母菌为啤酒酵母(Saccharomyescerevisiue),均由淮阴工学院生命科学与化学工程学院微生物实验室提供。培养基:细菌用培养基为营养琼脂培养基;霉菌、酵母菌用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。1.2正交试验的设计将鲜青香蕉皮经清洗、去杂、灭酶后准确称取10g,移入圆底烧瓶,以丙酮-水体系为提取液进行提取。选L9(33)做正交试验,确定提取香蕉皮中单宁的最佳工艺参数。选取的因素及水平如表1。试验时在水浴状态下进行回流提取,将提取液过滤,浓缩成浓度为1.0%的溶液待用。1.3准溶液配制采用磷钼酸-磷钨酸比色法(F-D法)进行测定。(1)F-D试剂配制:750ml水中加入钨酸钠100g、磷钼酸20g、磷酸50ml,回流2h,冷却至室温,并稀释为1L。(2)单宁酸标准溶液配制:称取单宁酸50mg于50ml容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度,混匀,再用蒸馏水稀释10倍即为0.1mg/ml标准溶液。(3)单宁酸标准曲线绘制:吸取单宁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml,分别置于盛有30ml蒸馏水的50ml容量瓶中,加F-D试剂2.5ml及饱和Na2CO3溶液5ml,加水稀释至50ml。充分混合,并于30min后在650nm处测定吸光度值。记录吸光度值,并对单宁酸体积(ml)作图。(4)样品测定:吸取待测样品液,与标准溶液相同方法测定,从标准曲线中读取样品中单宁的含量,测定不同成熟度香蕉皮单宁含量。1.4香香蕉皮的单次抗菌效果的测定1.4.1菌种悬浮液的制备将相应的菌种接到斜面培养基上,细菌在(37±1)℃下恒温培养24h,霉菌和酵母菌于(28±1)℃下恒温培养48h,连续培养3次,以无菌生理盐水配制成孢子或菌体悬浮液,浓度为106～107CFU/ml,备用。1.4.2保鲜液用量的确定采用滤纸片法,以无菌生理盐水和0.5%山梨酸钾水溶液作为对照。将直径为6mm的滤纸片160℃干热灭菌后置于0.5%的提取液中浸泡24h,并用无菌水和0.5%山梨酸钾水溶液作为对照,进行相同处理。将制备好的菌悬液0.2ml滴入到已倒有相应培养基的培养皿中,涂布均匀,用无菌镊子将滤纸片放入含菌平皿中,每皿4片,每种菌做3个重复,分别放入培养箱中培养,测量各供试菌的抑菌圈直径,取平均值。1.4.3决定是否患有抗菌试验以抑菌圈直径大于6mm者评价为有抑菌作用,无菌水对照组应无抑菌圈产生,否则试验无效。无菌水对照组所测直径为滤纸片直径。1.4.4培养基的制备将制备好的液体培养基121℃下湿热灭菌30min,冷却至50℃后以每试管10ml进行分装,将单宁粗提物配制成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0%系列浓度的单宁培养基,每1系列接种1种菌,每个浓度做3个重复,置于培养箱中培养,另取无菌水作对照。将培养后的培养物与空白对照在紫外可见扫描仪上进行比色测定,以二者吸光度基本相同,即培养基中没有菌落生长的最低浓度为香蕉皮中单宁的最低抑菌浓度。2结果与分析2.1鲜香蕉皮提取物提取测得单宁标准曲线的回归方程和香蕉皮中单宁的提取率公式分别为:Y=0.0879X-0.015,r=0.9988单宁提取率=P×V1V2×m×100%=Ρ×V1V2×m×100%式中,Y为单宁在650nm波长处测定的吸光度;X为相当于0.1mg/ml单宁标准溶液的体积(ml);m为鲜香蕉皮的质量(mg);V1为提取液总体积(ml);V2为比色时所吸提取液体积(ml);P为从标准曲线查得的提取液所含单宁(mg)。2.2单因素对香蕉皮单株提取率的影响以青香蕉皮为试验材料进行提取,由极差分析(表2)可知,影响香蕉皮单宁提取率的各因素的主次关系依次为浸提温度(A)>料液比(C)>浸提时间(B),说明温度对单宁提取率影响最大,其次是料液比,最后是浸提时间。同时由表3方差分析可见,在1%显著水平上,浸提温度(A)和料液比(C)对单宁提取率的影响极为显著,而浸提时间(B)对单宁提取率的影响不显著。香蕉皮单宁提取的最适组合为A2B2C3,即提取温度60℃,提取时间10h,料液比1∶14。由表4可知,香蕉皮中的单宁含量并不高,总均提取率在0.588%左右(波动在0.283%～0.933%之间)。在统计学水平上有如下结论:在1%显著水平上,各成熟度香蕉皮间单宁含量均有极显著差异,提取量最大的青香蕉皮单宁含量0.882%,提取量最低的黑色香蕉皮单宁含量0.304%,下降了0.578个百分点。2.3香香蕉皮的独特抗菌效果把香蕉皮单宁提取液利用旋转蒸发仪进行浓缩,经感官鉴定,为黄褐色的黏稠固体,完全干燥后为黄色粉末,有特殊的香味。2.3.1啤酒酵母的抑菌效果由表5可知,香蕉皮单宁提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌的抑制效果非常强,抑菌圈直径达到13.51mm;对啤酒酵母的抑制效果差,无抑菌圈产生;对黑曲霉及黄曲霉的抑制作用较差,抑菌圈直径在6.85mm左右。山梨酸钾与之相比,对细菌的抑制效果差,抑菌圈直径仅在7.53mm左右;对真菌的抑制效果则强于香蕉皮单宁提取物,抑菌圈直径达到了13.55mm。提示香蕉皮单宁提取物可以用于抑制细菌性2.3.2菌株mic的测定由表6可见,香蕉皮单宁提取物对细菌的抑制作用远远大于真菌:对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为0.1%,对枯草芽孢杆菌的MIC是0.2%,对黑曲霉和黄曲霉的MIC为1.0%,对啤酒酵母的MIC超过1.0%。这一试验结果进一步验证了滤纸片法的测定结果。3废弃物的提取量与其他一些植物果实相比,香蕉皮中的单宁含量不高,仅在0.588%左右,而黑枣中的单宁含量达2.82%,葡萄籽中单宁含量达23%,石榴皮中的单宁含量达到了80.33%,这与被提取的原料有极大的关系。虽然香蕉皮中的单宁含量不高,由于香蕉皮作为废弃物资源极为丰富,提取量仍很可观。有资料显示,单宁的抗微生物作用机制主要是由于单宁能够与酶作用形成复合物,抑制微生物酶的活性;另外,单宁还可以作用于微生物细胞膜与微生物细胞膜抑制电子中继系统有关,会对微生物膜造成一定的损伤。山梨酸钾为酸性防腐剂,山梨酸钾对霉菌和酵母菌的抑制作用强于对细菌的抑制作用,能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性细菌的活性,还能防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等有害微生物的生长和繁殖。本研究的结果表明,山梨酸钾对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌的抑制作用远低于单宁提取物,而对受试黄曲霉和黑曲霉以及啤酒酵母的抑制效果较好,远强于香蕉皮单宁提取物。因此,在防腐剂的制备过程中,可考虑将天然提取物单宁和山梨酸钾等化学防腐剂进行复配,对防止食物中毒和食品保藏方面会有广阔的应用前景。4香蕉皮有机溶剂提取香蕉皮单宁提取过程中,影响提取率的各因素的主次关系依次为浸提温度(A)>料液比(C)>浸提时间(B),最佳提取条件为:提取温度60℃,提取时间10h,料液比1g∶14ml。香蕉皮中的单宁含量并不高,提取率仅在0.588%左右。不