四逆汤对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体的保护机制

四逆汤对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体的保护机制

心力衰竭是一种常见的临床综合征，其发病和发展仍难以有效控制。阿霉素(ADR)是临床常用的抗肿瘤药物,其心肌毒性导致的心力衰竭时有发生。四逆汤(SND)是汉代张仲景《伤寒杂病论》中记载的名方,本课题组的既往研究表明,四逆汤具有较好的改善冠状循环、清除氧自由基的作用。阿霉素诱导的心力衰竭的发生机制与氧化应激密切相关,但有关线粒体在此过程中的作用仍不十分清楚。本实验即通过测定心衰大鼠心肌线粒体肿胀情况,膜脂质过氧化产物丙二醛含量,线粒体MnSOD、ATP酶活力及MnSOD的基因表达,探讨SND在蛋白和基因水平上对ADR性心力衰竭的保护作用机制。1材料表面1.1实验动物普通级SD大鼠,体重200-220g,雄性,中山大学实验动物中心提供。1.2逆汤部分作用物质盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司),DEPC(AMRESCO),琼脂糖(Yito),Trjzol(Invitrogen),M-MLV逆转录酶(Fermentas),RNasen(BBI),TaqDNApolymerase(BBI),四逆汤煎剂由附子、干姜、甘草按5∶3∶2比例用水煎制成0.375g生药/ml,邻苯三酚,硫代巴比妥酸(TBA),三氯醋酸(TCA),硫酸亚铁(FeSO4·7H2O),四乙氧基丙烷(TEP)等均为国产分析纯试剂,考马斯亮兰蛋白定量试剂盒及ATP酶活力检测试剂盒均购于南京建成生物医学工程研究所。2方法2.1尾静脉组snd动物饲养1周后,随机分为三组,对照组(control),心衰组(model)和四逆汤组(SND),每组8只。心衰组和四逆汤组以ADR3mg/kg剂量尾静脉注射,对照组以生理盐水等体积尾静脉注射,1次/5天,共3次。第三次注射后,四逆汤组给予四逆汤煎剂灌胃(3.75g生药/kg),对照组和心衰组给予等体积双蒸水灌胃,1次/天,共3周。2.2biolp自身的检测实验结束时用20%乌拉坦溶液(5ml/kg,ip)将大鼠麻醉,固定,右侧颈总动脉插入心导管至左心室,经压力换能器接Biolap生理记录仪,记录±dp/dtmax及LVEDP。实验完毕后取心脏备测。2.3sod活性的测定以匀浆介质(Tris10mmol/L,EDTA-2Na0.1mmol/L,蔗糖10mmol/L,NaCl0.8%,pH7.4)将心肌组织在冰上充分匀浆后,10000rpm4℃离心10min,取上清液再以10000rpm4℃离心15min,沉淀为线粒体。将分离的线粒体用冰冻的匀浆介质制备成混悬液,考马斯亮兰法测定蛋白浓度。取0.2ml线粒体悬液(蛋白浓度1mg/ml),4℃超声破碎线粒体膜3min,4000rpm离心15分钟,取上清SOD抽提液以邻苯三酚法测定SOD活性。取0.25ml线粒体悬液(蛋白浓度1mg/ml),加入2ml20%TCA振荡混匀,3000rpm离心10min,取上清1ml加入0.67%TBA1ml,沸水浴15min,室温冷却,在532nm波长比色,MDA含量由TEP标准曲线换算。2.4心肌嘴唇水肿tis-kcl缓冲液tis-kcl取0.25ml线粒体悬液(蛋白浓度1mg/ml),加入1ml含10-5mol/L硫酸亚铁的Tris-KCl缓冲液(50mmol/LTris,150mmol/LKCl,PH7.4,新鲜配置)37℃水浴12min,于520nm比色,以吸光值的降低作为大鼠心肌线粒体肿胀的指标。2.5试剂盒添加量以下简称“试剂盒”取0.20ml线粒体悬液(蛋白浓度1mg/ml),按试剂盒使用说明书进行操作。酶的活性单位以每小时每毫克蛋白质分解ATP产生的无机磷的微摩尔数(μmolpi/mgprotein/hour)表示。2.6pcr检测心肌总rna表达引物设计及合成:通过GeneBank检索获得大鼠MnSODmRNA(GenebankM25157)及β-actin(GenebankNM-031144)全序列,用美国Primer引物设计软件自行设计引物(上海生物工程公司合成),其序列如下:MnSOD扩增产物长度372bp5′-GAGCAGAAGGCAAGTGGTGA-3′5′-ACAGTTAGCAGGCCAGCAGA-3′β-actin扩增产物长度444bp5′-GCTACAGCTTCACCACCACA-3′5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′实验结束时用Trizol提取各组心肌总RNA,紫外分光光度计测A260及A280,比值介于1.8-2.0之间,根据A260计算总RNA含量,-20℃保存备用,0.8%琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。逆转录过程按试剂盒说明操作,PCR反应体系为25μl,10×PCRbuffer2.5μl,2.5mMdNTP2.5μl,25mMMgCl22.5μl,cDNA3μl,上游引物和下游引物终浓度为0.8μmol/L,各加1μl,TaqDNApolymerase0.5μl,加入无核酸酶水至总体积25μl。然后执行如下反应条件:94℃1min,55℃1min,72℃3min,循环35次,取10μl扩增产物,进行2%琼脂糖凝胶电泳,结果拍照,采用法国VILBERLOURMAT凝胶成像及分析系统进行光密度扫描(IOD),以各组条带IOD和相应的β-actin条带的IOD比值表示mRNA表达的强弱。2.7多组间比较s实验数据均以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法进行双侧检验,α值界定为0.05。结果应用SPSS11.0统计软件进行分析。3结果3.1拉伸压力变化心衰模型组心肌舒缩功能降低明显,左心室舒张末期压力显著增加;SND组则可以明显改善心功能,与对照组相比无显著差异(P>0.05),但仍然低于对照组,见表1。3.2mda含量测定心衰组心肌细胞线粒体肿胀明显,MnSOD活性明显降低,MDA含量显著升高;与模型组相比,SND组可保护线粒体膜,减少线粒体的肿胀程度,并明显提高MnSOD的活性,减少MDA的生成,从而减轻线粒体膜的脂质过氧化损伤,见表2。3.3胞线虫na+-k+atp酶和ca2+atp酶活力变化ATP酶活力的变化由表3可见,阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心肌细胞线粒体Na+-K+ATP酶和Ca2+ATP酶活力明显减低,而应用SND治疗后,则可明显提高Na+-K+ATP酶(p<0.01)和Ca2+ATP酶(p<0.05)的活力,保护心肌线粒体的功能。3.4各组大鼠心肌细胞mnsodmtsa的发现心衰组MnSODmRNA的表达与对照组相比显著减少,SND组则可明显提高MnSODmRNA的表达。见表4及图1。4云环境因素对心力衰竭大鼠心肌中氧自由基活性的影响阿霉素是临床常用的广谱抗肿瘤药物,1973年Lefrak首次报道了其心脏毒性,致其临床应用亦因此而受到了限制。有关阿霉素心毒性的确切机制仍不十分清楚,但如能在其抗肿瘤的同时,给予适当的心肌保护药物,将大大改善其临床应用效果。本实验研究发现,连续给予大鼠静脉注射阿霉素后,机体产生一定的药物累积效应,随着时间的延长,导致大鼠心功能明显下降,并出现心力衰竭的表现,而应用经典中药方剂四逆汤后,则可明显提高左心室±dp/dtmax,增强心肌舒缩功能,并有效降低LVEDP,从而改善阿霉素诱导的心功能下降,减轻其心肌毒性。目前研究发现,阿霉素心肌毒性的产生机制与自由基产生增多,钙超载,抑制核酸等的合成及影响能量代谢有关,其中氧自由基的毒害最为引人注意。而线粒体呼吸链是自由基产生的主要部位,其本身也很容易成为自由基损伤的主要靶点。本实验观察到,心衰大鼠心肌线粒体的MnSOD活性明显下降,而MDA的含量却显著上升,说明阿霉素作用于动物机体,造成膜脂质过氧化反应增强,产生了明显的氧化应激反应。进一步的RT-PCR分析表明,阿霉素可能是通过减少MnSODmRNA表达来降低心肌本身抗氧化酶活性,削弱心肌的抗氧化能力,从而造成心肌细胞抗损伤能力下降,心功能下降。而服用四逆汤后,心肌线粒体中的MDA含量降低,有效抑制了膜脂质过氧化反应,从而削弱心衰心肌中氧自由基的损伤性作用。与此同时,SND还可以通过增强心肌线粒体MnSOD的mRNA基因表达,来进一步提高SOD的活性,保护了线粒体,保证了心肌的能量供应,增加防御性的因素来对抗损伤。线粒体是细胞供能的主要细胞器,一旦受到损伤,将造成能量供应的减少。ATP生成的减少,自由基产生的增加,将会使线粒体膜上的ATP酶蛋白破坏从而造成其活性的下降。本实验还观察到,阿霉素作用于大鼠造成心衰后,心肌细胞线粒体明显肿胀,失去其膜的完整性,Na+-K+ATP酶活力明显下降,可能造成线粒体膜PT孔的异常开放,离子流平衡紊乱,进而可能诱导心肌细胞的凋亡。另外线粒体是参与调节细胞内Ca2+平衡的重要细胞器,生理情况下可通过其膜上的Ca2+ATP酶调节并缓冲胞浆中的Ca2+浓度,维持细胞与线粒体的钙稳态。本实验中,