草莓酒发酵菌株的筛选及发酵特性研究

草莓酒发酵菌株的筛选及发酵特性研究

草莓是蔷薇科多年生草本植物。有各种各样的东西。这些水果又红又亮，柔软多汁，酸甜可口，闻起来很香。具有清热消火、脾胃调解酶、明朝养肝、预防心血管疾病等多种营养素。由于草莓果肉柔软多汁、水分含量高、呼吸强度大、果皮较薄、耐贮性差,再加上生产季节性强,成熟收获期较为集中,导致果实贮藏运输中腐烂比例较高。我国近年来草莓种植面积和产量迅速增加,因此对草莓的深加工势在必行。将草莓,包括难以鲜销的残次草莓加工成优质的发酵果酒是减少草莓损失、提高草莓产品附加值的重要途径之一,将有广阔的市场前景。香气成分是决定果酒风味、质量与典型性的主要因素。影响果酒香气成分的因素很多,其中酵母菌种是决定果酒色泽、香气、感官质量和风格的一个非常重要的因素。国内外有关果酒的香气成分组成和含量已有大量研究,近年来的工作重点已转移到对香气成分的影响因素。影响香气成分的因素研究主要集中在发酵方式、超高压催陈老化等方面,而酿酒菌种对其影响研究较少,且只见对葡萄酒有相关报道,草莓酒在该项的深入研究至今尚未见报道。本实验采用气相色谱法分析自选酵母菌株D、E、H发酵的草莓酒在发酵过程中主要香气成分的变化,并通过对降糖速率、产酒精能力、产酸量及感官质量评价,比较不同菌株的发酵特性,考察酵母菌种对草莓酒香气成分变化的影响,以期为草莓酒的工业化生产提供参考。1材料和方法1.1试剂、仪器和仪器丰香草莓购于大连市水果批发市场。菌株A为本实验室保存菌(酿酒酵母),菌株D、E、H为本实验室自选菌。YEPD培养基:酵母浸粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL,pH6.0,115℃湿热灭菌20min。果胶酶(酶比活力20万U/g)河南洛阳夏盛果汁果胶酶有限公司;二氯甲烷(AR)北京北化精细化学品有限责任公司;丁酸乙酯、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、正丁醇、乙酸正戊酯、己酸甲酯、异戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇天津基准化学试剂有限公司。S-3C雷磁pH值计上海精密科学仪器有限公司;WYT-5手持糖量折光仪上海大庆光学仪器厂;FID检测器山东经纬分析仪器有限责任公司;N2000色谱工作站浙江大学智达信息工程有限公司。1.2选择菌株的鉴定筛选菌株的菌落和细胞形态鉴定、生理生化特性实验参照《微生物学实验手册》。1.3草坪酒的制备工艺1.4培养条件:l一级种子液:从斜面上挑取两环酵母菌,分别接入5mL10g/mL的糖水中,30℃恒温培养24h。二级种子液:将一级种子液接入100mL的草莓稀释汁(V汁:V水=1:1)中,30℃摇床培养24h,使酵母菌数达到1×109CFU/mL。1.5草莓酒的感官评估1.6质量分析方法酒精体积分数、还原糖和滴定酸含量的测定参照GB/T15038—1994《葡萄酒、果酒通用试验方法》;pH值采用S-3C雷磁pH值计测定;可溶性固形物采用WYT-5手持糖量折光仪测定;草莓酒香气成分采用GC7890Ⅱ气相色谱仪测定。气相色谱分析样品处理方法:用8层纱布过滤草莓酒,取过滤样20mL,加入等量水蒸馏,收取馏分35mL,分别用15、10、10mL二氯甲烷萃取3次,每次萃取30min,合并有机相,取少量萃取液用于酒精体积分数的测定。将萃取液浓缩至1mL,供气相色谱分析。气相色谱分析条件:FFAP石英毛细管色谱柱(30m×0.32mm,0.5μm);起始温度40℃,保持5min,以15℃/min升至180℃,保持5min;进样口温度250℃,检测器温度250℃;载气:N2:30mL/min,H2:30mL/min,空气:300mL/min;分流比1:50,柱前压0.1MPa,进样量1μL。2结果与分析2.1选择菌株的形态特征通过菌落和细胞形态及生理生化特性分析(表2、3),初步鉴定菌株D为汉逊氏酵母属、菌株E为克勒克酵母属、菌株H为裂殖酵母属。2.2种常用内容对比对4株酵母菌发酵所得草莓酒进行感官评定,由实验室成员组成评定小组参照GB/T15038—1994相关内容进行品评,结果见表4。由表4可知,菌株H发酵的草莓酒呈琥珀红色,澄清透亮,酒体丰满醇厚,果香酒香浓郁,具有草莓特有的香气,口味纯正、柔和协调、风格典型,明显优于其他菌株发酵的草莓酒,感官评定分数较高。2.3不同菌种的还原糖和可溶性固糖含量变化规律草莓酒中的还原糖和可溶性固形物含量直接影响酒精产量、酒的口感和风味,是酿酒工业中控制生产和决定工艺的重要参数。在一定范围内,糖分增加可提高发酵酒精体积分数,但糖分过高,在提高酒精体积分数的同时,也提高某些高级醇、琥珀酸等副产物的生成量,导致果酒口味苦涩刺喉。由于草莓含糖量低,本实验采用一次加糖法将含糖量调至22%进行发酵。分离菌株发酵草莓酒的还原糖和可溶性固形物含量变化见图1、2。由图1、2可知,4种酵母菌的还原糖和可溶性固形物含量变化趋势相近。发酵初期还原糖含量均有所上升,因为发酵体系呈酸性环境(pH3.33),加入的蔗糖在酸性条件下水解,导致还原糖含量升高。前8d发酵处于旺盛时期,含糖量急剧下降;8~12d变化幅度较小,表明主发酵过程已完成。尽管趋势相同,但不同酵母菌种的还原糖含量和可溶性固形物含量差异较大。菌株D的还原糖含量和可溶性固形物含量与对照菌株A相近,菌株E和菌株H的含量明显低于对照菌株A。菌株H起酵速度快,糖分利用率高,发酵彻底,发酵结束时还原糖含量降至1.83g/L,可溶性固形物含量降至8.65%。这与菌株H的生长和繁殖速率较快密切相关。2.4发酵草莓酒的ph值及滴定酸含量分析草莓果实中的酸类物质主要为有机酸,其中柠檬酸占总酸量的80%~90%。草莓汁发酵液初始酸含量要适宜,酸含量过低,pH值过高,不利于酵母菌的生长代谢;酸含量过高,pH值过低,则影响果酒的口感和风味,故起始发酵液选择草莓汁自然pH3.33。分离菌株发酵草莓酒的pH值和滴定酸含量变化见图3。如图3所示,滴定酸含量均呈上升趋势,其中菌株E的滴定酸含量增长速度快,含量高,其后依次是菌株H、菌株D和菌株A。发酵过程中pH值均呈小幅度(3.17~3.33)下降趋势,且不同菌株间的pH值差异不大。发酵过程中乙醇氧化为乙酸,如果生成具有芳香气味的低级酯的能力较弱,就累积有机酸,滴定酸含量升高就较多;如果乙醇氧化为乙酸的能力较弱或大部分乙酸生成了低级酯,且酵母菌生长繁殖旺盛消耗一部分苹果酸、柠檬酸和大多数氨基酸,则滴定酸含量升高就较少。草莓发酵液也具有一定的缓冲作用。2.5酒精体积分数月内日分数不同酵母对原料的利用率及产乙醇能力不同。分离菌株发酵草莓酒的酒精体积分数变化如图4所示。由图4可知,菌株D、E、H发酵草莓酒的酒精体积分数变化趋势相同,前8d酒精体积分数持续快速增长,8~12d增长较缓慢。原因是前期酵母细胞大量繁殖,能将更多的糖类物质转化为酒精,发酵旺盛,产酒精速率快;到后期,部分酵母细胞由于营养成分不足等原因开始衰亡,产酒精速率减慢。比较酒精体积分数变化曲线发现,菌株D和菌株E产酒精能力差异不大,菌株H稍高于二者,酒精体积分数达12.92%,各菌株均较对照菌株A起酵快,但发酵结束时酒精体积分数均较对照菌株略低。2.6发酵草莓酒香气成分的变化果酒的香味取决于大量具有香味的化合物,包括来自于原汁的果香,来自于酵母菌、细菌发酵产生的发酵香味以及老化过程中形成的香味物质。草莓酒具有自身独特的香气成分,至今已知的香气成分在300种以上,主要是在发酵过程中由酵母产生的酯类和醇类。其中,异丁醇具有酒香和植物草味;异戊醇具有酒香和果香;乳酸乙酯具有较强的酒香气味,是清香型酒的主体香气;而β-苯乙醇具有清甜玫瑰的香气,香气柔和但不持久。菌株发酵草莓酒香气成分的气相色谱分析结果见表5。由表5可知,草莓酒的香气成分主要为醇类和酯类,其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、正丙醇、乙酸异戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇含量占总含量的91.5%,菌株A、D、E、H的这9种香气成分总含量分别为18.54、30.81、26.61mg/L和37.42mg/L。4种酵母菌发酵的草莓酒排在前3位的香气成分相同,分别是异戊醇、β-苯乙醇和异丁醇,说明各酵母所产主要香气成分一致,但主要香气成分的含量不同,因此决定了草莓酒香气质量。发酵过程中各种物质的含量变化差异很大,其中乙酸乙酯、正丙醇和异丁醇含量持续上升,乙酸异戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、异戊醇和β-苯乙醇在接近发酵结束时有小幅度回落,而丁酸乙酯含量变化甚微。菌株A产正丁醇能力最强,菌株D产乙酸异戊酯能力最强,误差范围内4株菌产丁酸乙酯的含量无明显影响,菌株H的其余各