数字全息成像技术在生物医学领域的应用

数字全息成像技术在生物医学领域的应用

1数字全息成像的基本原理在生物和生命周期研究中，我们希望能够在玻璃罐体的培养液中观察和观察生物细胞，了解细胞的结构形状、动态特征、生物化学参数、细胞之间的相互作用、细胞对药物的反应和转移信息，这对早期医学诊断和药物设计开发非常重要。然而,当前的定性、二维和较慢成像速度的显微成像方法已经不能满足生物医学研究和发展的需求,迫切需要可实现定量、三维和快速跟踪的成像方法。由于生物细胞一般为相位型或者类相位型物体,只能提供振幅像的传统光学显微镜很难清晰分辨细胞边缘,且其成像焦深较短,每次聚焦只能获取物体的二维图像,对样品的厚度、位置以及三维形貌的观测非常困难。为了提高细胞成像的对比度,人们提出了荧光显微镜,但使用该显微镜前需要利用罗丹明、吖啶橙或绿色荧光蛋白等物质对生物细胞进行染色预处理［１］,此预处理增加了操作的复杂度,且不可避免地会影响生物细胞的生理特性。为此,各种光学相衬显微成像方法得到快速发展,如广泛使用的泽尼克相衬显微镜、微分相衬显微镜、激光共焦显微镜和光学相干层析术等［２－３］。但随着生物医学和生命科学的迅速发展,这些方法已经不能满足对生物活细胞的动态定量观测需求,例如泽尼克相衬显微镜和微分相衬显微镜的基本原理是把相位信息变换成强度信息,该变换一般是非线性的,因而测量的相位信息只是定性的。激光共焦显微镜和光学相干层析术虽然可以进行物体的三维形貌测量,但这两种显微镜都需要对样品进行精确扫描,导致成像系统的结构十分复杂,且成像历时长,不能实现实时动态测量。在以上技术基础上也提出了其他改进的全视场定量相衬成像方法,如希尔伯特变换相位显微术(HPM)、傅里叶变换相位显微术(FPM)和衍射相位显微术(DPM)等［４－７］。然而,在这些方法中,有的需要扫描镜和平移台等机械运动装置,系统结构复杂,有的则需要波前传感器及多次曝光。数字全息术利用面阵光电探测器(如CCD、CMOS)代替传统光学全息记录介质(如银盐干板、感光胶片),将全息图以数字化的形式存储于计算机中;然后计算机运用衍射传播理论模拟全息再现时光波的传输过程,通过数值计算得到定量的物光波场的振幅和相位分布,实现了全息图记录、存储和再现全过程的数字化。数字全息技术具有如下的优势［８－１２］:1)实时性:光电图像传感器能够记录运动物体的各个瞬时状态,再现过程省去了繁琐的化学湿处理过程,提高了图像信息处理速度,可用于实时处理的场合;2)信息丰富:利用单幅全息图就能定量地得到被记录物体再现像的振幅和相位信息,不仅可以得到反射型物体的形貌分布,还适用于透明或半透明物体的定量相衬成像;3)结构简单:无需任何扫描装置即可对微小物体进行无损检测,同时可以方便调节再现距离得到不同再现距离下的物光波分布,对物空间进行逐层成像,实现全场观察与测量;4)灵活性:可利用现代数字图像处理技术处理数字全息图,减少或消除在全息图记录过程中的像差、噪声与畸变等因素的影响,提高再现像质量;5)无损性:数字全息无需像荧光显微镜那样要对待测样品进行染色等预处理。综上可见,数字全息成像是一种新型的实时、非破坏性的全视场三维定量相衬成像方法。数字全息显微成像(DHM)的横向分辨率取决于系统的数值口径,可以达到亚微米量级,而轴向分辨率可以达到亚纳米量级［１３－１５］。并且由于数字全息技术具有非破坏性和实时性,特别适合于无染色剂标记生物活细胞的定量相衬成像和三维重建,可实时获得细胞形貌和功能分析,这将为生物医学的研究提供各种定量参数,例如细胞的新陈代谢、生死、凋亡、可塑性、信号传输,细胞膜或细胞质的移动,细胞动力过程研究以及生物组织的成像等。近几年来引起了国内外科研人员的高度重视,并逐步应用到了生物学和医学成像等研究领域。本文针对生物医学方面的应用,介绍了生物细胞的数字全息相衬成像原理,从细胞形貌测量、生物学参数、生理状态、药效反应和动力学分析几方面,综述了数字全息成像方法在生物医学领域中的研究和应用进展,讨论了数字全息在生物医学方面的发展前景和存在的技术问题。2u3000细胞相位畸变校正数字全息作为一种定量的相衬成像方法,其本质是测量待测样品的透射光束或反射光束的相位延迟的光学相干成像方法。一般体外检测的生物细胞需要在培养液中生长,以图1中的透射生物样品检测为例,当光通过活体细胞这种相位型样品时,光强度变化非常小,因此细胞的振幅信息不能清晰地体现细胞结构。但是光在活体细胞和细胞周围物质中的传播速度不同,会产生相应的相位延迟。式中λ为入射光波波长,z为轴向坐标,hｍ和nｍ分别为细胞培养液的高度和折射率,hｃu3000ｘ，ｙ是细胞内位于(x,y)处的细胞厚度,nｃu3000ｘ，ｙ(z)表示细胞内(x,y)处沿着轴向z的折射率分布,nｃu3000ｘ，ｙ表示细胞平均折射率,即因此,由细胞的相位延迟фｘ，ｙ可以反推得到细胞的厚度数字全息利用光电探测器CCD记录参考光波和物光波的干涉图样,即为数字全息图式中O和R分别是传播到CCD平面的物光波和参考光波的复振幅分布,“*”为共轭运算。在计算机中首先对全息图进行数值处理,得到全息图的数值再现,实现物光波从全息图平面到物平面或者物体像平面的衍射传播［１９－２０］。由(4)式可知全息图再现像将包含三部分,第一部分是前两项形成的零级像,第二和第三部分是由(4)式的第三和第四项形成的原始像和共轭像,其中第三项携带了物体的全部信息。根据参考光和物光有无夹角可以分为同轴数字全息和离轴数字全息。若数字全息光路为同轴结构,将会存在原始像、零级像和共轭像的重叠问题,需要采用相移技术或者迭代等算法去除零级像和共轭像［２１－２３］。若数字全息光路为离轴结构,原始像、零级像和共轭像基本不发生混叠,但会引入相位畸变,且往往相位畸变远远大于生物样品的相位信息,因此要获得细胞的准确相位,必须要对数值再现像进行相位畸变校正［２４－２５］。如果细胞的相位信息大于一个光波长,还要对再现像进行解包裹处理才能最终获得细胞的相位信息ue788ｘ，ｙ［２６］,如图1(b)中获取的年轮细胞的相位像,从而最终实现细胞相位和形貌信息的检测。3预放大数字全息成像装置生物细胞的尺度在亚微米到几十微米量级,根据成像视场和分辨率的要求不同,可采用不同的数字全息成像装置。为了观测单个或少数几个生物细胞的形貌特征,需要较高成像分辨率,往往采用基于显微物镜(MO)的预放大数字全息显微成像装置［２７－３４］。为了分析大量细胞的形态变化和动态特性,需要较大的视场,可以采用无透镜傅里叶变换数字全息成像装置［３５－３７］。下面将介绍这两种典型的面向生物医学应用的数字全息成像装置。3.1像面预放大数字全息在预放大数字全息系统中,为了提高成像分辨率而在物体和全息图平面之间适当位置放置一个显微物镜,对待测物体进行放大,该放大物光波与参考光干涉后,利用CCD即可记录放大物体的全息图。预放大数字全息图的记录原理如图2(a)所示［１０，３４］,xｏ-yｏ平面、xｍ-yｍ平面和x-y平面分别是物平面、MO平面和全息图平面。图2(b)为预放大数字全息显微成像装置的结构示意图［２８］,为了方便放置生物培养皿,成像系统为倒置结构,激光器发出的光被耦合进光纤,又被光纤分束器分为两束,分别作为物光和参考光;物光经扩束准直后从上往下照在培养皿上,参考光经过扩束准直后与经显微物镜放大后的物光发生干涉,利用CCD探测得到全息图,经第2节中介绍的后续数值处理,即可再现生物细胞的形貌信息。需要指出的是,在该实验结构中有个特殊情况,即当全息图平面与像平面重合时,此时称为像面预放大数字全息。预放大数字全息显微成像的特点是视场较小、分辨率较高。系统分辨率由光波波长λ和显微物镜的数值孔径(NA)决定,系统的理想分辨率为［３８］此外,由于生物样本表面相对于照明光波长而言存在随机粗糙,导致成像受到散斑噪声的干扰,特别是当培养液体混浊时散斑噪声显著［３９］,将会大大降低成像质量。针对这一问题,Dubois等［４０］提出了部分相干光预放大数字全息显微成像装置,采用发光二极管(LED)作为光源,通过降低光源的时间相干性提高成像信噪比。3.2全息成像装置无透镜傅里叶变换数字全息的记录过程如图3(a)所示,xｏ-yｏ平面、x-y平面分别是物平面和全息图平面,P为球面参考点源,其坐标位置为δ(xｏ-xｒ,yｏ-yｒ),且参考光源与物平面在同一个平面内,记录距离为z０。无透镜傅里叶变换数字全息成像装置的结构如图3(b)所示［３６］,从激光器发出的光由偏振分束棱镜(PBS)分成两束光波,两束光波均经过扩束滤波系统(BE),其中一束光波通过待测物体作为物光波,另一束光波通过显微物镜产生点光源作为参考光,实验中调节光路使点光源和待测样品到CCD平面的距离相同,实现物光与参考光共面。无透镜傅里叶变换数字全息图本质是记录了物体的频谱,通过全息图进行一次快速逆傅里叶变换即可实现数值再现。相对于普通离轴菲涅耳全息系统来说,无透镜傅里叶变换数字全息对被测物体的横向尺寸约束小,具有较大的空间带宽积,能充分利用CCD的带宽,降低对CCD空间分辨率的要求［３６］;与预放大数字全息相比,无透镜傅里叶变换数字全息的成像分辨率较低,但成像视场较大。无透镜傅里叶变换数字全息装置的横向分辨率与记录距离z０、CCD的幅面尺寸LＣＣＤ的关系为［４１］4基于数字充分技术的生物样品成像和分析研究4.1数字全息成像的实验结果1992年Haddad等［３５］最早将数字全息用于生物样品成像,实现了无透镜傅里叶变换数字全息图的记录和再现,得到了寄生虫细胞的三维图像。2004年,Carl等［２７］利用预放大数字全息成像(MO:20×,NA=0.4)装置实现了悬浮活体肿瘤肝细胞的相衬检测,其横向分辨率为0.86μm,轴向分辨率为30nm。此后,随着高分辨率大幅面CCD器件、高速CMOS器件、计算机运算性能及先进数字图像处理技术的快速发展,利用数字全息进行活体细胞形态、行为和功能检测的研究大量涌现。Rappaz等［３０－３１］利用预放大数字全息成像(MO:60×,NA=0.8)对活体小鼠皮层神经元细胞进行了成像［２９］,结果如图4(a)所示,其相位测量精度为2ue5804ue580,轴向测量精度为160320nm,将实验结果与泽尼克相衬显微镜和微分相衬显微镜进行了对比,结果显示数字全息成像能提供更好的信噪比和清晰度。Rappaz等［３０］对人体红血球细胞进行了检测,结果如图4(b)所示,并据此分析了细胞的体积、面积和高度等信息。国内,董可平等［４２］采用预放大数字全息成像(MO:10×,NA=0.25)获得了新鲜洋葱表皮细胞的形貌结构。马利红等［３３］利用显微物镜(60×,NA=0.85)对样品进行放大,实现了活体血红细胞和草履虫的数字全息显微成像。王华英等［４３－４４］利用数字全息显微成像实现了中药饮片细胞的形貌检测。结合光纤搭建了倒置式预放大像面数字全息显微系统(MO:20×,NA=0.4),实验中将CCD放置在物方像平面上,系统的横向分辨率为0.977μm,实现了无标定的老鼠大脑海马区神经元活细胞的定量相衬成像,结果如图5(a)所示,可清晰观察到胞体、树突等形态结构,获得了神经元细胞形态的基本参数,该研究期望为研究海马区神经元细胞的活动对于记忆的运作机制等方面提供基本的生物参数依据［３４］。神经球是神经干细胞在体外扩增培养过程中的一般表现形式,普遍应用于神经干细胞的体外培养,还基于预放大像面数字全息显微系统(MO:10×,NA=0.25)获得了神经球的相衬成像,结果如图5(b)所示。数字全息还可提供较大的视场,实现大量细胞的显微成像,可用于微生物识别、细胞计数等。Moon等［４５－４６］分别构建了单次曝光同轴数字全息和部分相干计算全息两套成像系统,结合Gabor小波变换和主成分分析等算法对向日葵干细胞进行了微生物成像、形态识别和自动分类,结果表明对于类相位型或者相位型样本来说,基于数字全息三维成像的识别性能远远好于二维成像。基于无透镜傅里叶变换数字全息成像提出了一种自动无损的细胞培养状态监测方法,结合图像分割技术得到了宫颈癌细胞(HeLa)生长的汇合度参数,充分发挥了数字全息全视场和实时检测的优势［３６］。4.2细胞相位信息与合理有效位置细胞折射率是活体细胞的重要生物参数之一,可以反映细胞的内部结构和生物特征变化。由(1)式可以看出,细胞的相位信息取决于细胞的折射率和厚度,因此细胞的相位信息也携带了细胞的折射率信息。目前主要采用如下两种方法获取细胞的折射率参数。4.2.1细胞分光光程差检测细胞培养液对不同的波长具有不同的折射率,导致双波长光路下细胞的光程差不同,因此可利用双波长照明实现细胞折射率的二维测量。细胞折射率与细胞光程差的关系为［４７－４８］式中nｃ(x,y)为细胞的平均折射率,nｓλ１、nｓλ２为细胞培养液在波长λ１和λ２下的折射率,lλ１和lλ２分别为在波长λ１和λ２下获得细胞的光程差。Rappaz等［４８］利用双波长预放大数字全息成像方法,借助灌注介质逐渐增强的色散特性,分别测量了细胞的折射率和厚度。双波长预放大数字全息成像装置的结构与图2(b)类似,采用数值孔径为0.85的63×显微物镜,不同之处是将可调谐激光器作为光源。由于灌注介质的吸收系数是波长的函数,在不同的波长下可分别测量生物样品的相位信息。图6(a)为在490nm光源照射下获得的两个酵母细胞的相位图,图6(b)为分别在490、500、600、625、663nm五个波长照明下获得的右侧酵母细胞的光程差,可见不同的波长照射下就可以得到不同的光程差,在染料吸收峰的附近选择两个波长,通过(7)式即可求得生物样品的折射率分布［４８］。4.2.2全息图成像系统基于数字全息显微术的光学衍射层析成像方法首先记录物体的多角度衍射信息,然后再通过相移技术或相位复原算法获取物体的复振幅分布,最后利用Radon变换计算定量的三维折射率分布。在预放大数字全息装置的基础上,采用多角度照明位置固定的物体,或者用一束固定方向的光波照明旋转的物体这两种方式,均可获取物体的多角度衍射信息［４９－５０］。Charriere等［４９］构建了预放大数字全息装置(MO:63×,NA=0.85),将红豆杉花粉粒置于小型微量吸管中,利用电动旋转台控制小型微量吸管的旋转,记录多幅全息图,获取了红豆杉花粉的折射率分布,然而在相位复原中采用了相移技术,因此获取单一方向的相位信息也需要采集多幅全息图,这就降低了系统的稳定性和效率。为了进一步优化上述装置,实验中将样品放置在一个专门设计的腔内,这个腔主要是由两个正交于光轴的显微镜盖玻片组成,从腔的一边使用微量移液器操作样品,将微量移液器固定在一个机械旋转台上,通过微型平台调整它的位置,使样品细节部位准确地放置在旋转轴上,系统的横向和轴向分辨率均优于3μm,折射率测量精度优于0.01［５０］。利用该成像系统获得了两种凤蝶茄壳虫的折射率层析分布,结果如图7所示。数字全息衍射层析成像方法的优势是无需改变生物样品的生长环境,即可实现折射率的三维分布。此外,Rappaz等［１７］通过渗透方法获取了正常状态下和不同膨胀状态下活体小鼠皮层神经元细胞的折射率,但是这种方法需要改变细胞的培养环境。Lue等［５１］为了从相位信息中解耦出细胞的折射率和厚度,将细胞局限在微流控芯片中,通过分别测量只有培养基和水、以及在培养基中培养了细胞这两种状态下的相衬像,实现了折射率的测量,但这种方法需要将细胞注入到微流控芯片中进行检测。4.3细胞生理状态分析4.3.1特定表型的细胞细胞分化是胚胎细胞分裂后未定型的细胞,在形态和生化组成上向专一性或特异性方向分化,或由原来较简单具有可塑性的状态向异样化稳定状态进行分化的过程。机体一切组织细胞分化时的主要特征是细胞出现不同的形态结构和合成组织特异性的蛋白质,演变为特定表型的细胞类型［５２］。Alm等［５３］利用数字全息成像观测贴壁3T3L1成纤维细胞的分化过程,对贴壁3T3L1成纤维细胞利用0.5mM(M表示单位mol/L)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),质量浓度为10μ羐/mL的胰岛素和1μ罬地塞米松处理3天后,该细胞分化为脂肪细胞,利用数字全息成像可以明显看到脂肪细胞中的脂质颗粒,而其他相衬显微镜无法清晰分辨这一信息。Chalut等［５４］利用预放大数字全息系统(NA=1.4)对人早幼白血病HL60细胞进行相衬成像,发现在细胞分化过程中会有重要的物理变化。实验给出了诱导中性粒细胞和单核细胞在不同时刻的平均折射率分布,可以看到显著的核分叶特征结构,且在中性粒细胞和单核细胞分化过程中,随着时间的推移折射率均有明显下降。4.3.2细胞周期的检测在单细胞生物中细胞分裂就是个体的繁殖,在多细胞生物中细胞分裂是个体生长、发育和繁殖的基础。从细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束,所经历的过程称为细胞周期,细胞的生长和分裂的速度决定于细胞周期。细胞为了保持自身体积恒定,在一个细胞周期内需要使自身物质翻倍,因此可利用干物质(非水物质)表征生物大分子,干物质是指脱水细胞的质量,主要取决于蛋白浓度。因此检测干物质生产可以动态评估细胞周期。Rappaz等［５５］利用预放大数字全息显微成像在单细胞水平对野生型或突变型的裂殖酵母进行了干物质生产速率和干物质表面密度检测,为细胞周期分析提供了无损、定量、动态的测定方法,也使高通量药物筛选的应用成为可能。此外,他们还测定了正常红细胞和乙醇固定的红细胞全细胞表面上红细胞膜波动(CMF)的丰度。在计算CMF时考虑到了膜的方向、折射率等［５６］。Pan等［５７］设计了一种能够适用于细胞培养环境的光纤-空间光混合的预放大数字全息成像系统,研究了超磁场失重状态下造骨细胞的细胞分裂和形态变化。Kemper等［５８］利用预放大数字全息成像装置(MO:40×,NA=0.65)对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的细胞分裂过程进行了长时间的实时监测,结果如图8所示,图中箭头指示了细胞分裂的位置。细胞A、B和D分别在19.7,32.5,37.7h发生分裂,在整个过程中细胞C没有发生分裂。实验观察到在细胞分离前相位明显增加,在细胞贴附于支持物上的阶段,那些比细胞核、核膜及核仁周围密度高的亚细胞区域逐渐变得清晰可见。4.3.3细胞凋亡的表现细胞因受严重损伤而累及胞核时,呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化,导致细胞死亡。细胞死亡包括坏死和凋亡两类。细胞坏死为被动死亡,它是指细胞受到环境因素的影响,导致细胞死亡的病理过程。细胞凋亡又称为程序性死亡,属于主动死亡,为了维持机体内环境的稳定,细胞发生主动的,由基因控制的自我消亡过程［５２］。细胞凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系,而细胞凋亡与细胞形态具有密切联系。凋亡性体积减小是细胞凋亡早期阶段中的显著特点之一。Khmaladze等［１８，５９］利用预放大数字全息显微成像实时观测了大量口腔癌(KB)上皮细胞的凋亡性体积减小情况,在12μ罬的孢菌素作用下,在4h内人体上皮KB细胞凋亡性体积减小至40%,且将实验结果与原子力显微镜的结果进行了对比,误差在5%以内。4.4小鼠海马回复突变试验利用数字全息显微成像辅助分析药物对癌细胞的作用是目前的研究热点之一。Carl等［２７－２８，６０］采用数字全息显微镜研究了胰腺癌细胞的侵袭机制及抗癌药的作用机理。现有研究表明胰腺癌预后差的原因之一是在临床症状出现前及癌症诊断前就易形成微转移灶,但是目前对于决定其高度恶性生长及播散模式的分子机制尚不清晰。参与肌动蛋白骨架组成的E-钙粘着蛋白及其相关连环蛋白参与了胰腺癌的进展,这些蛋白决定了细胞的形状。研究显示加入LatrunculinB(可破坏肌动蛋白细胞骨架的毒素)后,高分化胰腺癌细胞Patu8988S(侵袭力低)在短时间内细胞肿胀,随之崩解。而低分化胰腺癌细胞Patu8988T(侵袭力高、易转移)则呈现细胞高度肿胀,但在观察期间未见到细胞崩解。表明与高侵袭力的胰腺癌细胞相比,非侵袭性胰腺癌细胞肌动蛋白细胞骨架的稳定性差。另外,Patu8988T细胞的肿胀也提示LatrunculinB不仅影响了肌动蛋白纤丝,而且也影响了调控信号转导的细胞环境。此外胰腺癌细胞(Patu8988T)加入抗癌药Taxol后,采用倒置数字全息显微镜每隔120s记录一次,持续记录16h,表明Taxol首先诱发Patu8988T细胞圆化、细胞厚度增加,随后诱导细胞崩解。部分药物的有效成分难溶于水,只能溶于极性较高的有机溶剂,药物溶剂本身对癌细胞的影响会直接干扰药效评价的准确性,有必要评价有机溶剂自身对癌细胞的作用。利用预放大数字全息显微成像系统对正常对照组、甲醇体积分数分别为12.5%,25%和50%条件下生长的HeLa细胞进行了形态检测,结果如图9所示［６１］。利用图像分割方法提取了活体细胞的形态信息,采用细胞面积,细胞光学平均厚度和细胞最大平均光学厚度三个参数定量评价细胞的形态变化。结果显示与正常对照组相比,甲醇体积分数为12.5%和25%的细胞面积降低显著(P<0.01),表明低体积分数甲醇具有毒性,会导致细胞收缩;甲醇体积分数为50%的细胞面积没有显著变化(P>0.05),表明高体积分数甲醇对活体细胞具有固定作用。甲醇作用下的细胞平均厚度与正常对照组相比均有明显差异,且细胞的最大平均光学厚度均比正常对照组要高。甲醇体积分数为50%条件下,虽然细胞面积没有显著变化,但细胞的光学厚度具有显著的变化。此外,Pavillon等［６２］利用数字全息对谷氨酸盐作用下的老鼠大脑皮层神经元进行了形貌和细胞体积检测,实验结果表明不可避免的相位下降是谷氨酸盐导致神经元细胞早期死亡的标志特征之一,基于细胞体积分析可评价药物毒性,预测后续是否会有一系列的细胞死亡发生。数字全息成像可以提供定量的相位信息,且其检测灵敏度可以用于区分健康细胞和不具有活性的细胞。4.5数字全息成像的优势主动的运动是一切生命体最显著的特征之一。作为生物体基本单位的细胞,其多种多样的生理活动,如细胞形态的改变和维持、细胞内物质的运输、内吞外排、免疫行为和细胞分裂等,无不伴随着各种形式的运动。细胞的迁移运动是依赖于细胞和附着基质之间所产生的力,以及收缩系统能够把细胞的某一部分从一点推或拉到另一点去的功能［５２］。目前大部分细胞运动学研究都是基于二维成像数据,然而在许多情况下细胞的三维运动与二维运动有重要区别,并且往往三维运动比二维运动包含了更加丰富的信息。荧光显微镜、霍夫曼显微镜等可实现细胞的三维运动检测,但是这些显微镜只能检测速度较慢的细胞迁移,不适于快速运动细胞的监测。此外,当细胞以一定速度运动到显微镜的离焦面上时,现有显微镜将无法获得准确的三维成像结果。而数字全息可对全息图进行数值再现和自动聚焦,利用这一灵活处理优势,使数字全息成像可以准确地获得高速和离焦平面上的物体信息。潘锋等［６３］长时间定量监测了骨细胞MLO-Y4的迁移过程。Dubois等［４０］基于LED光源构建了部分空间相干光预放大数字全息成像系统,该成像系统可以大大降低相干噪声,直接记录在基质凝胶这种散射十分严重的物质中培养的细胞信息,系统的横向分辨率为1.3μ羗,轴向分辨率为2nm。利用该系统对在特制保温培养皿中的22个纤维肉瘤HT1080细胞进行了13h的三维运动轨迹检测,并给出了每个细胞的平均运动速度和运动的最大距离。Sun等［６４］将同轴预放大数字全息和视频技术结合起来,构建了数字全息视频显微镜(DHVM),该系统可以视频记录细胞的快速运动,并利用血管中的在体血细胞进行了实验验证。Langehanenberg等［６５］采用倒置预放大数字全息成像系统对红细胞的沉淀过程和胶原组织模型中的HT1080细胞进行了实时观测,利用基于图像锐度的自聚焦算法获得了清晰的三维成像,定量给出了细胞迁移和运动过程中的转移量。图10给出了球形红细胞在重力作用下的沉淀过程,图10(a)为红细胞轴向位移Δg随时间t的变化曲线,图10(b)为红细胞的三维运动曲线。可见,重力作用下红细胞在30s内不断下落,下沉速度为(3.23±0.07)mm/h,可以清晰看到红细胞沉淀过程中的聚合物涂覆表面效应。当细胞靠近盖玻片时(t>30s),表面涂料阻止其贴敷,导致运动轨迹有一个小的跳变,并在沉淀过程完成后趋于稳定。整个沉淀过程中,细胞的轴向偏移超出了系统的焦深,因此自动聚焦在细胞的快速跟踪成像中起到了关键作用。5应用的前景和问题5.1数字全息技术与其他技术的结合随着数字全息技术的快速发展,数字全息显微成像已经成功用于静态细胞形貌检测、生物学参数测量和细胞动力学等生物医学研究中。在目前研究工作的基础上,数字全息技术可进一步与内窥镜技术和芯片技术结合,用于早期恶性肿瘤的诊断和其它病理学根源探究,例如病毒感染、神经变性和炎症等,使得临床诊断成为可能［６６］。数字全息技术与荧光显微镜和波前整形技术相结合,有望观察更多生物样品蛋白质的表达,可实现在各向异性介质中的成像和细胞的在体观测,进而实现多功能显微系统［６７－６８］。数字全息技术还可与生物光子学结合,观察分子水平的细胞功能和结构,实现用光子及其技术对生物系统的检测、加工和改造等［６４］。此外,近几年数字全息与太赫兹成像的结合得到了广泛的关注［６９－