动物细胞工程 【知识精研+拓展提升】 高考生物一轮复习 课件

第43讲

动物细胞工程情景三：俗话说是药三分毒，任何药物在使用过程中都会出现与治疗目的无关的作用称为副作用，副作用有时会对其他正常组织器官造成伤害，为降低抗癌治疗药物紫杉醇的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体药物偶联物（ADC）。思考讨论3：

请结合单克隆抗体制备技术，设计抗肝癌细胞的单克隆抗体的制备流程。杂交瘤细胞能分泌所需抗体1、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特点？2、动物细胞融合的原理、方法？3、融合后的细胞类型有哪些？

4、筛选杂交瘤细胞的方法、目的是什么？5、最终选出的杂交瘤细胞的特点？6、获得杂交瘤细胞后如何进行培养，并获得单克隆抗体？7、举例说明单克隆抗体还有哪些应用从社会中来在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？通过细胞培养构建的人造皮肤可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增；

目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤；给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作_______进行攻击。抗原考点一

动物细胞培养与干细胞的应用一、动物细胞培养1.概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。动物细胞培养需要哪些条件？2.原理：3.培养对象：：胚胎或幼龄动物的细胞较成体的细胞更易培养（原因：分化程度低，增殖能力强，更易于培养）细胞增殖（有丝分裂）应用：①人造皮肤的构建；②动物分泌蛋白的规模化生产；③用于药理及细胞发育方面的研究。4.培养的条件：①营养条件②其他条件无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境糖类、氨基酸、无机盐、维生素等一、动物细胞培养合成培养基液体培养基（需加入血清等天然成分）无菌技术添加抗生素定期更换培养液95%空气＋5%CO2的混合气体O2：细胞代谢所必需的CO2：________________维持培养液的pH36.5±0.5℃，7.2~7.4清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞造成危害取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞加培养液细胞悬液原代培养在培养皿或培养瓶中传代培养悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理分散成单个细胞后，再离心法收集5、动物细胞培养的过程培养结果：最终不能培养成动物体取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞加培养液细胞悬液原代培养在培养皿或培养瓶中传代培养5、动物细胞培养的过程（1）培养前为什么分散成单个细胞？①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖；

②利于与培养液充分接触，保证

O2与营养供应和代谢物及时排出。悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需用胰蛋白酶处理分散成单个细胞后，再离心法收集取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞加培养液细胞悬液原代培养在培养皿或培养瓶中传代培养5、动物细胞培养的过程（2）胰蛋白酶的作用：

。胃蛋白酶可以吗？理由。

。将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶没有活性。(3)在用胰蛋白酶处理时间是否越久越好？细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞，要控制好时间。胃蛋白酶作用的最适pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。（1）细胞贴壁—悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；根据癌细胞的特点，思考一下培养的癌细胞有没有接触抑制现象？癌细胞细胞膜上糖蛋白减少，细胞的黏着性降低，在适宜的条件下可以无限增殖，因此培养的癌细胞无接触抑制现象，在培养瓶中能够生长成多层。（2）接触抑制—

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞加培养液细胞悬液原代培养在培养皿或培养瓶中传代培养5、动物细胞培养的过程（4）细胞悬液第一次在瓶中培养，将分瓶之前的细胞培养，称为__________；

细胞悬液培养一段时间后，分瓶后再进行的细胞培养，称为__________。原代培养传代培养取动物组织（动物胚胎或幼龄动物）用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理单个细胞加培养液细胞悬液原代培养在培养皿或培养瓶中传代培养5、动物细胞培养的过程①收集细胞a.悬浮生长类：直接用离心法收集b.贴壁生长类：

重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。②将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养（5）分瓶培养的步骤：植物组织培养动物细胞培养原理取材培养基的物理性质培养基的特有成分特殊环境条件结果植物细胞的全能性细胞增殖离体植物器官、组织、细胞动物胚胎或幼龄动物的组织、器官固体液体(又称培养液)植物激素血清6.植物组织培养和动物细胞培养的比较再分化需光气体环境（CO2）获得植株个体，体现全能性获得大量细胞，不形成个体植物组织培养动物细胞培养过程外植体脱分化愈伤组织再分化根、芽幼苗完整植株移栽成活取动物组织制成细胞悬液转入培养液进行原代培养分瓶进行传代培养（1）培养前为什么分散成单个细胞？①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖；

②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。(2)在用胰蛋白酶处理时间是否越久越好？细胞膜含有蛋白质，长时间处理会损伤细胞，要控制好时间。（1）细胞贴壁—悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；根据癌细胞的特点，思考一下培养的癌细胞有没有接触抑制现象？癌细胞细胞膜上糖蛋白减少，细胞的黏着性降低，在适宜的条件下可以无限增殖，因此培养的癌细胞无接触抑制现象，在培养瓶中能够生长成多层。（2）接触抑制—

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。二、干细胞培养及其应用全能干细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）存在问题：胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用作出假设：已分化的体细胞类似胚胎干细胞的一种细胞

各种类型细胞病人体内体外诱导分化移植iPS细胞科学家利用载体将特定基因导入细胞中表达，体细胞可诱导转变为iPS细胞iPS细胞的诱导及应用成纤维细胞T细胞和B细胞导入特定基因导入特定蛋白小分子化合物诱导iPS细胞治疗阿尔茨海默症治疗心血管疾病2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），之后用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。2007年，科学家通过类似的方法成功诱导出人类的iPS细胞。p98题2优点：①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。干细胞应用面临的问题存在着导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用缺点：图1表示的是科学家获得iPS细胞（类似于胚胎干细胞），再将iPS细胞转入小鼠乙体内培养的过程，图2表示研究人员利用小鼠（2N=40）获取单倍体胚胎干细胞的一种方法，SrCl2溶液可激活卵母细胞。以下分析错误的是（

）A.图1过程中，成纤维细胞转变为iPS细胞，类似于植物组织培养中的脱分化过程B.研究人员将iPS细胞团注射入缺乏T细胞的小鼠体内，细胞团能继续生长。由此可推测图1中iPS细胞团逐渐退化的原因可能是小鼠乙发生免疫反应造成的C.图2中，研究人员使小鼠丙超数排卵，再利用SrCl2溶液处理后体外培养至④囊胚期，再筛选出单倍体干细胞D.研究发现，单倍体胚胎干细胞有发育全能性，该技术培育的单倍体动物可成为研究显性基因功能的理想细胞模型D科学家通过体外诱导成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。iPS细胞可来源于病人自身的体细胞。如图为iPS细胞的获得及用其培育不同种细胞的示意图(c－Myc、Klf4、Sox2和Oct3/4等基因与细胞的脱分化有关)。回答下列问题：(1)在对成纤维细胞进行培养时，常用胰蛋白酶处理使之分散成单个细胞，这说明细胞间的物质为_______，____(填“能”或“不能”)用胃蛋白酶处理成纤维细胞，原因是_____________________________________。(2)在培养iPS细胞的过程中，培养基中应含有细胞所需的各种营养物质，并定期更换培养液。定期更换培养液的目的是________________________________________________。(3)过程③④为iPS细胞提供的条件不同，分化得到的细胞不同，可知细胞分化是_______________的结果。若iPS细胞来源于病人自身体细胞的诱导，再将其分化出的细胞移入患者体内的优势是___________________。(4)如果诱导iPS细胞定向分化为原始生殖细胞，该技术可能的应用是_____________。蛋白质不能

多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中失活变性

清除代谢物﹐防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害基因选择性表达解决不育问题避免了免疫排斥问题动物细胞培养动物细胞培养的概念和原理干细胞培养及其应用营养条件；无菌、无毒的环境；温度、pH和渗透压；气体环境原理：细胞的增殖在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术干细胞的分布干细胞的类型干细胞的应用胚胎干细胞（ES细胞）成体干细胞动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程取动物组织单个细胞细胞悬液原代培养传代培养早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中主要应用在医学上【课堂小结】考点二

动物细胞融合与单克隆抗体的制备一.动物细胞融合技术1、定义：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2、原理：细胞膜的流动性3、结果：融合形成杂交细胞（具有原来两个细胞的遗传信息）4、融合方法：与植物原生质体融合相同电融合法、离心法聚乙二醇（PEG）融合法灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有）5、意义：①突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；②研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。③利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。方法生物方法：灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(P48相关信息)动物细胞融合完成的标志？细胞核的融合思考：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。诱导

融合原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(P48相关信息)植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能

考点二A.抗体的概念：抗体是机体受

刺激后产生的、并能与之发生特异性结合的具有免疫功能的

。B.抗体是由

细胞合成和分泌的，每种这种细胞能产生

（一种/多种）抗体。C.动物免疫反应中产生的抗体有

（一/多）种D.传统制备抗体的方法：向动物体内反复注射某种抗原，使之产生抗体，然后从动物

中分离所需要的抗体；其缺点是：

。E.为获得单一的抗体，

（能/不能）选用特定的浆细胞直接去培养；理由是

。研究背景抗原蛋白质浆多血清不能浆细胞已经高度分化，不能再分裂一种产量低，纯度低，特异性差单克隆抗体的制备注射特定蛋白免疫小鼠培养小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种细胞多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞选择培养基克隆化培养专一抗体检测注射到小鼠腹腔内增殖体外培养单克隆抗体诱导融合单克隆抗体的制备过程动物细胞融合动物细胞培养筛选一筛选二多次筛选特异性强、灵敏度高、可大量制备细胞增殖细胞膜具有流动性既能大量繁殖又能产生专一抗体（1）第一次筛选的目的：（2）如何筛选：（3）筛选原理：（4）杂交瘤细胞的特点：（5）第二次筛选的目的：（6）如何筛选：（7）选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_______________________（8）抗体检测原理__________________________________（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞（10）如何获取单克隆抗体①体外培养____________________________②小鼠腹腔内培养____________________________（11）单克隆抗体的优点筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选

在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量繁殖，又能产生抗体获得足够数量的能分泌所需抗体杂交瘤细胞

用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）阳分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用①作为诊断试剂诊断疾病②运载药物治疗疾病③作为药物治疗疾病在生物体内与特定目标细胞或组织相结合，具有导向作用连接抗体与药物细胞毒素、化学药物、抗癌药物等治疗作用单克隆抗体诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势。ADC在临床上用于治疗癌症或其他疾病，具有疗效高、毒副作用小的特点优P3592．(选择性必修3P50思考·讨论)抗体—药物偶联物(antibody­drugconjugates，ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。(1)ADC的抗体和药物各具有什么作用？__________________________________________________________________________________。(2)除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？_________________。(3)单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？_________________________________________________________________________________________________________________________________。ADC的抗体在生物体内与特定目标细胞或组织相结合，具有导向作用。药物起治疗作用化学药物、抗癌药物等单克隆抗体诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势。ADC在临床上用于治疗癌症或其他疾病，具有疗效高、毒副作用小的特点优P3616．[2020·全国Ⅰ，T38]为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_____________________________________________________。(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：___________________________________________________________________________________________________。诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋