基因研究的历史与现状

基因研究的历史与现状

基因研究是生命科学的核心。自1865年提出孟德尔的遗传理论以来，在这138年中，人们一直在寻找基因、识别基因、分离基因、操作和开发基因，并为人类的健康服务。回顾这一百多年生命科学发展的历程,在基因的研究中最核心的研究对象是人,即定位和克隆决定人体各种性状的基因、与人类疾病相关的致病基因以及能够用于疾病治疗与预防的功能基因。近50年来,在基因研究核心领域中共获得18项诺贝尔生理医学奖、11项诺贝尔化学奖,并由此带动了基因诊断、产前诊断(prenataldiagnosis)、遗传咨询(geneticcounseling)、基因药物及基因治疗的发展,开启了一个崭新的基因时代。人类大约有3万～4万个基因。纵观个体发育过程,人的基因在精子与卵子结合受精的那一瞬间就决定了。基因决定了人的生物学性状,甚至行为。个体所有的细胞所包含的基因都是相同的,在胚胎发育阶段,一些基因打开,一些基因关闭,出现了细胞的分化,形成不同类型的细胞,不同类型的细胞形成不同类型的组织,不同类型的组织形成不同类型的器官;同样,在个体发育不同阶段,有的基因开放,有的基因处于关闭状态,从而决定不同的生物学特性及健康状态。到2003年5月19日止,科学家已记载了102种染色体病,已定位了2122种遗传病和肿瘤的致病基因,已克隆了1352个疾病基因。大部分染色体病及某些遗传病的致病基因在受精后就有表达,从而导致流产、死胎等现象,在胚胎发育的过程中被淘汰,这本身就是自然选择,是人类进化的保证。但有些致病基因在人体胚胎发育阶段或出生时并不表现出疾病,而是在出生后的不同年龄阶段(儿童期、少年期、青年期、中年期、老年期等)出现疾病。我们对已知的引起严重缺陷、先天畸形等具有遗传家族史的孕妇,可行产前诊断,必要时终止妊娠;但对在出生后不同年龄阶段出现的迟发性疾病,特别是中年期、老年期发病的遗传性疾病和恶性肿瘤,如遗传性小脑性共济失调、老年性痴呆、恶性肿瘤等,绝不可做出终止妊娠的决定。因为,迟发性疾病的患者在他们发病前,能健康地生活约30～60年,甚至更长,这期间他们不但能正常劳动,建立温馨的家庭,共创人类文明。有的还可能成为大科学家,为人类作出重大贡献。所以,无论家庭与社会均有责任为他们治疗疾病,让他们共享现代科学文明。目前,临床上可以成功地进行心脏、肝脏、肾脏、肺脏等器官的移植手术,挽救和延长生命;恶性血液病、神经系统变性病等(如老年性痴呆、帕金森病)可以通过细胞移植技术得到有效治疗。但由于器官来源困难及供者和受者基因型不同而造成排斥反应,导致手术后要长期服用免疫抑制剂来抗排斥,严重影响了生活质量。1997年,多利羊的克隆,推翻了科学家关于成体细胞不再具有发育成为一个新个体的全能性理论,即体细胞核在一定条件下可以逆转,分化成为器官或生命个体。目前世界范围内克隆羊、克隆牛等已成为一件常事。2001年,被世界著名杂志《Science》评为十大基础研究成果之一的“干细胞技术”证明,在哺乳动物和人体的某些组织中可分离出干细胞,这些干细胞在一定的条件下能定向诱导成为其他类型的细胞或组织,然后用于自身疾病的细胞治疗或基因治疗,成功地克服了异体细胞之间的免疫排斥反应。1990年,第一个“基因治疗”方案在美国被批准进入临床试验,短短十几年,据美国2002年的统计,已有636个方案进入临床试验。治疗患者例数超过5000人。治疗方案中癌症属首位,其次是单基因疾病和艾滋病。科学家一致认为,基因治疗是一些难治之症的希望,已成为当今生物医学领域发展史上的一个重要里程碑。1999年,法国巴黎Necker儿童医院利用分离的自体造血干/祖细胞作为靶细胞,以腺病毒载体作为基因治疗载体,成功治疗了2例重症联合免疫缺陷病(SCID)患儿,并于2000年在《Science》发表了该研究成果的论文。至今已经治疗了11例,从而开创了一个新的“个体化”基因治疗的时代。尽管其中有2例患者出现了类白血病反应,后查明是由于病毒载体随机插入的位置效应激活了癌基因的结果。医学遗传学国家重点实验室在夏家辉院士的领导下,经过20余年的研究,以人类自身的额外小染色体为原件,构建了容量为5kb、100kb和300kb的3种“人源基因载体”,利用该载体将FIX、TPA、Endostatin、CD等基因导入细胞后,不但能定点整合,而且能有效、稳定地表达,可望以“人源基因载体”这一原创性的研究成果为核心,解决目前基因治疗中使用病毒载体引起新发肿瘤等问题,建立起一套安全的、以保藏自体细胞为靶细胞的、进行个体化人类遗传病和恶性肿瘤基因治疗的体系。一、医学指导遗传咨询是应用遗传学和临床医学的基本原理和技术,确诊并解答遗传病患者及其亲属,以及有关的社会服务人员所提出的关于遗传学方面的问题,并在权衡现在与未来、个人与家庭、社会利弊的基础上,给予婚姻、生育、防治、预后、教育、就业等方面的医学指导。从而,降低遗传病患儿的出生率,促进家庭幸福、社会安定,提高民族素质。也就是说,孟德尔的分离、自由组合定律,摩尔根的连琐、交换定律,遗传病的群体调查与临床遗传学研究是遗传咨询的理论基础,遗传咨询必须建立在综合采用染色体、基因和临床检测技术对疾病作出诊断的前提下,由遗传学专家、临床医学专家及实验技术专家组成的群体共同完成。二、新生儿细胞检查产前诊断是采用一切可以应用的技术(物理、生化、遗传等技术)对胎儿尽早做出诊断,包括筛查和诊断性检测。筛查是针对胎儿有发生某种遗传病高风险进行的,而诊断性检测必须建立在先症者确诊(包括染色体水平、基因水平、表型水平)基础上,也就是说产前诊断是有目的性的。产前诊断方法包括两大类,即创伤性方法和非创伤性方法。前者包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样、胎儿镜和胚胎活组织检查等;后者则包括超声波图像以及母体外周血胎儿细胞检测。尽管创伤性产前诊断方法有可能对母体或胎儿产生不同程度的损害,但是由于这些损害可以通过操作技术的改进和经验的积累并在先进设备(如高分辨超声波仪)的配合下予以避免,或使之减轻到最低限度,因此目前产前诊断仍以创伤性方法为主,并以羊膜腔穿刺最为常用。无创、简便、准确、自动化的临床诊断方法是近年来产前诊断研究的热点,除了染色体病的检测方法已发展到分子水平外,不少分子遗传学诊断方法应运而生。随着人类基因组序列的破译,大量的高密度的遗传标记已被定位,利用这些遗传标记进行连锁分析将简化遗传病的诊断。胚胎组织活检技术的成熟、单细胞聚合酶链反应(PCR)基因诊断技术和单细胞荧光原位杂交技术(FISH)染色体检测技术的成功建立,利用这些技术进行植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD),为孕妇减少妊娠致死性遗传病胎儿及反复引产造成的痛苦,开辟了一条崭新的道路。三、衍生染色体间的分离和重组携带者(carrier)是带有染色体结构异常但表型正常的个体。由于他是人群中部分三体和部分单体综合征产生的主要原因,故将其特别列出。可分为易位和倒位两大类,至今已记载16000余种,我国已记载1200余种,几乎涉及到每号染色体的每个区带。其共同的临床特征是在婚后引起流产、死产、新生儿死亡、生育畸形或智力低下儿等妊娠、生育疾患;有的类型出现分娩畸形儿和智力低下儿的可能性高达100%。根据广泛的群体调查,在欧美的发生率为0.25%,即200对夫妇中就有一对夫妻的一方为携带者;而根据夏家辉等在长沙的调查,携带者在我国的发生率为0.47%,即106对夫妻中就有一方为携带者。因此,为了防止染色体病患儿的出生,检测出携带者及进行宫内诊断,在我国更具有重要意义。易位携带者主要包括相互易位携带者、整臂易位携带者、罗伯逊易位携带者、移位携带者、转位携带者5大类;倒位携带者主要包括臂间倒位携带者和臂内倒位携带者两大类。在他们的配子形成中染色体的配对和交换将产生各种异常的配子,通过受精则可形成各种部分单体和部分三体综合征的患儿。作为相互异位携带者的一个例子,如46,XX,t(2;5)(q21;q31)在减数分裂中,通过同源染色体间的配对,将形成“四射体”,不论在哪一位点发生互换,通过邻近-1和邻近-2分离,以及12种可能的3∶1分离,至少可形成18种合子,其中仅一种为正常者,一种为表型正常的易位携带者,其他均为部分三体或部分单体患者。但没有任何一种类型出现新的结构重排,故称为衍生染色体,可记述为der(2)和der(5)。见表1。作为倒位染色体的一个例子,如46,XX,inv(2)(p21q31),在减数分裂中通过同源染色体间的配对,将形成“倒位环”,如果在倒位环内发生交换,则在一个重组染色体中将导致2p重复,rec(2)dupp,inv(2)(p21q31),而在另一重组染色体中,将导致2q重复,rec(2),dupq,inv(2)(p21q31),通过与正常配子结合则可形成46,XX,rec(2)dup(2p),inv(2)(p21q31)和46,XX,rec(2)dup(2q)inv(2)(p21q31),倒位染色体在减数分裂中形成的倒位环dupq,inv(2)(p21q31)的合子,在第1种核型中表示2pter到2p21的重复和从2q31到2qter的缺失,在第2种核型中,表明从2q31到2qter重复和从2pter到2p21的缺失。由于它是继发性重排的产物,故称为重组染色体,记述为rec(2)。90%以上的先天愚型为21,三体型[47,XX(XY),+21],少数为G/G或D/G易位型,以及嵌合体46,XX(XY)/47,XX(XY)+21。若患儿为21,三体型,双亲核型正常,可以肯定患儿为新发生的突变,但因为群体中21,三体的发生率与孕妇的年龄密切相关(表2),则在估计其再生育21,三体患者的风险时应按表2的危险率作出估计,而不能简单地运用一般群体的发生率(1.5‰)。若父母之一为D/G易位携带者,则生育患儿的理论危险率为1/2,但由于流产等因素,患儿实际出生的危险率约为5%～10%。若父母之一为21/21同源的平衡易位携带者,再出生患者的可能性为100%;若双亲之一为21/22平衡易位携带者,再出生患儿的危险率为1/2。当母体21,三体血清学筛查阳性;孕妇年龄超过35岁;父母之一为D/G或G/G易位携带者必须做诊断性检测,如羊膜腔穿刺;如胎儿诊断为21,三体综合征,建议引产。对已出生的患儿,应建议加强对患儿的教育。我国武汉21,三体综合征患者“舟舟”,经后天教育在音乐指挥方面所表现的模仿才能,说明教育的重要性。这里举例说明此病的情况:先证者,男,35岁,结婚8年其妻妊娠7胎。第1胎,女孩,出生时哭声特别小,20h后死亡;第2胎孕70d自然流产;第3胎,孕7个月生一男孩,哭声不大,脚畸形,唇裂,数小时后死亡;第4胎在服感冒药后人工流产;第5胎妊娠4个月,因死胎引产;第6胎,男孩,出生后哭声不大,呼吸困难,3个月后,死于肺炎。第7胎因害怕出生异常儿而人工流产。G显带分析初步诊断患儿核型可能为46,XY,der(7)t(7;9)(q2200;p24),der(8)dirins(8;7)(q2204;q2200q3204),der(9)t(9;7)(p24;q3204)。用显微切割、PCR技术构建的人类7号和8号染色体特异性探针池。对患者染色体中期分裂相进行染色体绘画,结合G显带染色体检查结果,确认患者的染色体核型应为46,XY,der(7)t(7;9)(q2200;p24),der(8)invins(8;7)(q2100;q31.2q2200),der(9)t(9;7)(p24;q31.2).ishder(7)t(7;9)(wcp7+)der(8)invins(8;7)(wcp7+,wcp8+),der(9)t(9;7)(wcp7+)。基于该复杂易位携带者的3条异常染色体及其4个断裂点没有一个发生在同源染色体间的事实,可以肯定这种突变是在其父、母的精子或卵子形成以后,受精以前所发生的“一次击中”事件所形成的。如果某一电离粒子正好击中7号、8号和9号染色体的某一交叉重叠点,而引起7号染色体发生两处断裂(7q2200和7q31.2),8号染色体和9号染色体各发生一处断裂(8q2100和9p24),其断裂后的染色体发生变位重接,则可形成相应的异常配子。这种异常的配子与正常的配子结合成合子后,发育成一个表型正常的复杂易位的男性携带者,他结婚后可引起妻子的习惯性流产、死胎和生育早夭的畸形儿等。综上所述,本例研究不但说明染色体异常携带者的形成,是外因作用于染色体DNA分子而引起染色体在分子水平上的断裂与变位重接的结果,而且说明应特别注意加强生育期男女的性腺保护,如在X射线等检查中应注意保护性腺等,同时在遗传咨询中对这种复杂易位携带者,应建议采用精子库中的他人的