浅谈新生代的亲属因子

浅谈新生代的亲属因子

1987年，laskey通过对两组蛋白素和dna的外部生理强度进行实验时发现，需要在内核中含有一些酸性蛋白质，这些物质可以转化为核小型体。否则，就会沉淀，提出了最初的分子伴侣概念。后来,Ellis在研究高等植物叶绿体中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)时也发现类似现象,即在叶绿体中合成的8个大亚基以及在细胞质中合成的8个小亚基,都必须先和一种蛋白结合后,才能在叶绿体内组装成活性酶分子。因此提出在普遍意义上帮助新生肽链折叠的分子伴侣概念。1993年Ellis对分子伴侣的定义是:分子伴侣是一类相互之间有关系的蛋白,它们的功能是介导蛋白质正确的折叠与装配,但并不构成被介导的蛋白质的组成部分。现今这个概念已得到了补充和发展。1分子落实论co-so的结构与功能目前认为,分子伴侣(molecularchaperone)是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象,并能通过有控制的结合和释放,促进新生多肽链的折叠、修饰、装配、以及错误多肽链的降解。应该指出的是,分子伴侣是从功能上定义的,凡具有这种功能的蛋白质都是分子伴侣,它们的结构可以完全不同。这一概念目前已延伸到许多蛋白质,现已鉴定出来的分子伴侣主要属于几类高度保守的蛋白质家族,其成员广泛分布于原核及真核细胞中。其中大部分成员属于热体克蛋白(heatshockprotein,Hsp),根据其结构与功能的差异,分子伴侣包括几个结构上不相关的蛋白质家族:Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、SmallHsps(smHsp)、钙联接蛋白(Calnexin)、TCP-1环复合体(TCP-1containingringcomplex,TRiC)、核浆素(Nucleoplasmin)、辅助分子伴侣Co-chaperone(DnaJ、GroES、Cpn10)和折叠酶等。其中研究比较清楚的是Hsp70/DnaK和Hsp60/GroE系统,尤其对后者即伴侣因子的研究进展较快,已在Cell,Nature等重要杂志先后报道,本文综述如下。2真核生物中的小体糖1,5-二磷酸羧化酶抑制剂清髓工酶的结构及分布伴侣因子是一种普遍存在的蛋白质家族,一般结构是由两个圆环背靠背组成的一个大圆柱体,每个圆环是由具有ATP酶活性的分子量约60kD的亚基构成。圆柱体中央的空腔是蛋白质折叠的重要场所,它提供了底物蛋白折叠所需的封闭环境,参与协助其它蛋白质多肽的折叠修饰等。根据伴侣因子来源及同源性的特点可将其分为两大组:第一组(GroupI)伴侣因子存在于细菌及真核生物中的内生同源细胞器(线粒体和叶绿素),成员包括细菌内的GroEL、真核生物线粒体中的Hsp60(Cpn60)以及叶绿体中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶结合蛋白(RubiscoBondingProtein)。第二组(GroupII)伴侣因子存在于古细菌及真核生物的胞质中,成员有古细菌胞质内的温度传感器(Thermosome)和嗜热因子55(thermophilicfactor55,TF55),以及真核生物胞质内的含有TCP-1的伴侣因子(chaperonincontainingTCP-1,CCT),也称为TCP-1环复合体(TCP-1containingringcomplex,TRiC)。2.1第一组离婚因素这一组伴侣因子中尤以对大肠杆菌中的GroEL的结构、功能研究较为详细,促进了人们对伴侣因子的认识和了解。2.1.1groel亚单元的结构及其与合成肽的关系早在1978年,Georgopoulos等学者研究发现,大肠杆菌中的λ噬菌体生长时,必须有GroE的存在,GroE系统是由GroEL及其它的辅助分子伴侣GroES组成。GroEL蛋白是同型寡聚复合物,由14个相对分子量为57kD的亚基组成;GroES是由相对分子量为10kD的亚基组成的七聚体环,连在GroEL的末端。GroEL的电镜图像显示其圆柱体状的颗粒中有一个中央腔,腔内可以被底物多肽占据。Braig等用X-ray结构分析得到了GroEL更加清晰的图像,证实GroEL分子类似一个直径137,高146的圆筒(?=10-10m),它的14个亚基背靠背构成两个圆环,两个圆环围绕形成两个独立的宽45空腔,此空腔作为多肽底物折叠的空间。每个GroEL亚单元可以被分成3个不同的区域:(1)赤道结构域(equatorialdomain),由第6～133和409～523氨基酸残基构成,它组成圆筒的中央部分且主要为α螺旋,具有调节所有中间接触及大部分内部接触的作用。同时还含有面向中央腔的ATP结合位点。(2)顶端结构域(apicalregion),由第191～376氨基酸残基构成,与赤道结构域不同,其构相变化不稳定。它位于GroEL圆筒的开口处,且含有GroES和多肽底物的结合位点。多肽结合在由两个面向中央空腔的单环形成的疏水槽内,这与早前使用定点突变分析所得结构相吻合。(3)中间结构域(intermediatedomain),也被称为铰链结构域(hingedomain),由第134～190和第377～408氨基酸残基构成,其作为分子链连接顶端结构域和赤道结构域,作用是传导两结构域间的变构信号,及建立核苷酸结合部与GroES/多肽结合部之间的紧密偶联。辅助分子伴侣GroES是一个圆顶型的七聚体,直径75,高30。它几乎全部由β折叠构成,Landry等发现,天然的GroES有一个高度活动及趋向性的多肽袢环,袢环的活动性及趋向性随GroEL/GroES复合体的形成而消失。对合成肽的研究还发现,袢环与GroEL上的一个发夹结构相结合,而此结合位点与底物结合位点是不同的。袢环的活动性及趋向性,可能使得它的七个部分更容易与GroEL的七个亚基同时结合,这样可使每部分采取不同的排列,借此变构效应来调整GroEL/底物的亲和力。GroES与GroEL的顶端结构域结合,且要求GroEL环上的氨基酸位点与ATP或ADP结合。GroES的袢环与GroEL的疏水肽沟槽结合并固定。2.1.2中间结构域和底物的变化GroE可以促进其它蛋白多肽的折叠,同时,GroE在蛋白质跨膜转运和蛋白质插入E.coli细胞质膜过程中起重要作用。GroE是最早被研究,也是研究最详细的伴侣因子,它已成为辅助蛋白折叠的模型。多年来,已有很多关于GroE结构和功能的研究结果,使得我们可以更好地理解分子伴侣工作的基本原理。GroEL与GroES、ATP等组成一个协助蛋白折叠的系统,其实质是给非天然多肽(nonnativepolypeptide)提供一个隔离的工作平台,其工作过程是由ATP的结合与水解所驱动的分子伴侣构象变化的循环,此循环分三个步骤:(1)GroEL摄取多肽底物;(2)随着GroEL与GroES及ATP的结合,底物被置于一个可以促进蛋白折叠的特殊微环境中;(3)随着ATP的水解,多肽被重新释放到溶液中。这三种功能状态的转变主要由ATP、GroES、底物与GroEL的结合而产生变构效应。GroEL与底物的结合,主要是顶端结构域与非天然构象底物蛋白的疏水性结合,引起显著的构象改变,尤其是顶端结构域构象的改变(环向上、向外旋转)使空腔直径几乎增大一倍,体积由原来的850003增大到1750003。随后,GroEL中组成多肽结合位点的疏水残基离开空腔表面,被空腔壁覆盖,这时空腔内部就成为一个亲水表面。随后,GroES阻断空腔的出口,这时,空腔便由疏水多肽的受体成为蛋白折叠的闭合微环境。最后,ATP的水解导致GroES的解离,使底物蛋白释放出来。如果此底物蛋白并未达到天然构象,它还可以进人另一次循环。对分子机制的研究发现,中间结构域存在顺式、反式两种构象,其构象变化在与GroES的相互作用、结合ATP并将其水解以及对底物的折叠和解折叠中起到重要作用。GroEL是一类泛宿主性的伴侣因子,它可与许多底物蛋白相作用,据估算有300多种大小不一的蛋白多肽底物。其中多数参与重要物质的代谢,包括氨基酸代谢(腺苷甲硫氨酸合成酶),糖代谢(磷酸转乙酰酶),嘌呤嘧啶生物合成等等。另外在转录、翻译机器和酶的主要成分,如RNA聚合酶、核糖体蛋白、tRNA合成酶,等等,这些蛋白中大约有1/3结构不稳定,常需反复进入GroEL,以维持其正确构象。多肽与GroEL结合最初是基于疏水作用,这已由结合反应的热力学分析证明,同时静电的相互作用也可能起到一定的作用。与正确折叠的蛋白不同,未折叠或部分折叠的多肽常常会暴露其疏水表面,这些疏水表面会非特异的结合形成聚合物。所以蛋白多肽折叠不佳会导致蛋白质聚集。无生理作用的蛋白质大量聚集后,可以被溶酶体水解清除,但若过度聚集超出溶酶体的水解能力,可能会导致疾病的发生。GroE在蛋白质跨膜转运和蛋白质插入E.coli细胞质膜过程中起重要作用。Phillips等的实验表明,在GroEL功能缺陷的E.coli菌株中,分泌蛋白的输出受到损伤。根据荧光印迹结果分析,GroEL的膜靶蛋白是SecA,后者是转运机制中的一个中心蛋白,它与SecY形成蛋白质传导膜通道。GroEL与膜结合的SecA相互作用同某些生理活动是相关的,如GroEL能与新合成的分泌蛋白或膜蛋白相互作用,促进蛋白质跨膜转运或促进其插入细胞质膜中。GroEL作为分子伴侣参与蛋白质跨膜转运,可能是通过维持SecA在各种条件下的功能活性构象来实现的。当然,SecA并不是GroEL识别的唯一膜成分,别的未鉴定出来的蛋白质也可能与GroEL有作用。另外,在一些情况下,GroEL可以通过刺激SecA从膜中释放,来调节SecA与膜结合的周期。2.2cct和trc通过实验整合引物来表达第二组伴侣因子存在于古细菌及真核生物的胞质中,这类伴侣因子与第一组伴侣因子仅有很低的序列同源性,其结构及组分有一定的异质性。这类伴侣因子可能是由1～3种不同蛋白组成的八聚体或九聚体。其中最为复杂的就是真核生物胞质内伴侣因子,即前述的包含TCP-1的伴侣因子(CCT或TRiC)。最早发现此蛋白时,它的序列与真核细胞的T-复合体多肽-1(t-complexpolypeptide1,TCP-1)十分相近,随后TCP-1相关基因在真核细胞被发现,且证明其有分子伴侣功能,故现今仍沿用CCT和TRiC。而古细菌中的伴侣因子被称为温度传感器(Thermosome),是因为它们最早被发现存在于嗜热类生物。第二组伴侣因子的八圆环结构与第一组伴侣因子GroEL的七圆环在形态上有明显差异,同时二者功能上亦有差异。如上所述,GroEL是一类泛宿主性的伴侣因子,它可与许多底物蛋白相作用,而CCT具有一定的选择性,且有对细胞支架蛋白的倾向性,如对肌动蛋白和微管蛋白的作用。除此以外,CCT的作用机制与GroEL不同,因为其缺少像GroES一样帮助伴侣因子腔内折叠的辅助因子。下面以CCT为代表阐述第二组伴侣因子的结构和功能。2.2.1cct为双环复合体的一般形态伴侣因子分子较大,便于在电镜下观察,同时可以使用X-ray结晶成像术得到更加清晰的结构分析。电镜显示,CCT是一种典型的单体不同的双环复合体,复合体形状如桶,且有圆顶状的末端。CCT也是由两个圆环背靠背组成,每个环由八个不同的同源亚基构成(30%的同源性),亚基分别命名为CCTα,β,γ,δ,ε,ζ,η和θ亚基(酵母中称为CCT1～8),亚基在环内的排列是固定的。2.2.2其他分子中蛋白的缺失的功能早期的遗传学实验表明,TCP-1与细胞骨架,尤其是微管系统有关。近几年的研究证实,包括TCP-1在内的伴侣因子可辅助新合成的肌动蛋白和微管蛋白的折叠。Brown等在对中心体研究中证明Hsp73和TCP-1是中心体的组成成分,同时发现抗TCP-1抗体阻断微管从中心体的再生,并证明了TCP-1作为分子伴侣辅助微管蛋白的正确折叠与装配。这种伴侣因子可以直接与细胞骨架蛋白如α、β、γ微管蛋白、肌动蛋白及角蛋白接连,另外它还是中心体的组成部分,与微管的核化有关,只有古细菌中的成员有应激诱导性。3可能的随机性因素的临床意义3.1cpn60与胰腺疾病的关系Velez-Granell等发现,伴侣因子60(Cpn60)及其辅助因子10(Cpn10)在胰腺腺泡细胞中的分布与胰酶的一致,而且沿胰酶合成分泌的途径,即从粗面内质网(roughendoplasmicreticulum,RER)、高尔基体(Golgi,G)到酶原颗粒(zymogengranule,ZG)(RER-G-ZG),浓度不断上升,最终随胰酶排入腺泡管。这种Cpn60与胰酶共分布的现象提示Cpn60在胰腺中参与了胰酶蛋白合成分泌的过程。这一假说后来得到了有力的证明,Bendayan等用蛋白金标免疫细胞化学技术(proteinA-goldimmunocytochemistrytechnique)看到,沿胰酶合成分泌的途径,Cpn60与胰腺的脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶在量上有明显的相关性,且在分离的胰腺酶原颗粒中加入Cpn60抗体,上述消化酶与Cpn60同时被沉淀,表明Cpn60与其相伴行。由此联想到Cpn60与一些胰酶异常的疾病,如急性胰腺炎AP、糖尿病等发生发展的可能的关系。急性胰腺炎可由不同原因引起,而每一因素通过不同的机制引起胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原激活,进而损伤腺泡细胞及整个胰腺。已知胰腺蛋白酶过早激活引起胰腺自身消化性损伤是胰腺炎发生的一个重要事件,但其发生的机制尚不清楚。Lee等使用水浸润应激(water-immersionstress)大鼠,诱导其Cpn60高表达,可以防止腺泡细胞内的胰蛋白酶原的激活,从而减轻由雨蛙肽(caeruline)诱导的急性胰腺炎的严重程度。其他类似研究报道,热、酸、渗透压改变等应激状况,或休克等均可诱导Cpn60的转录及表达增加,这被认为是一种适应性细胞保护(adaptivecytoprotection)。在胰管逆行注射胆盐诱导的急性胰腺炎大鼠模型,胰腺腺泡中的淀粉酶,胰蛋白酶,脂肪酶含量持续在高水平,作为适应性细胞保护,Cpn60的含量应该上升,但有实验看到,胰腺腺泡细胞中Cpn60水平反而降低,尤以酶原颗粒中的更为明显,认为与胰酶伴行的蛋白伴侣相对不足,可能引起胰酶堆积于腺泡细胞,促使其胞内激活的发生。另外,急性胰腺炎时腺泡细胞内溶酶体增多、分布异常,加上胰脂肪酶以及蛋白酶含量增多,Cpn60含量减少,这些异常变化可能是胰酶胞内激活的