犊牛超排生产胚胎和胚胎移植研究

犊牛超排生产胚胎和胚胎移植研究

0同卵双胎桑胚人工诱导繁殖技术西门塔尔牛（borissen）是由瑞士西门塔尔牛和德系红景天混合而成的。整个育种过程有近150年的历史,特别是从20世纪80年代到现在,经过20多年的定向选育,逐步形成了特有的乳肉兼用的西门塔尔品系,具有较高的经济效益。该品系的主要特征是:遗传稳定,母牛产奶性能好,公牛育肥能力强,耐粗饲,抗病力强。据报道,德系西门塔尔牛与荷斯坦奶牛相比,与其他的牛进行杂交后,更能体现出其优越性,对改良中国奶牛、肉牛具有积极的意义。胚胎移植技术主要包括超数排卵、同期发情、胚胎移植等环节,目前已基本成为一项比较成熟的生物技术,能够充分挖掘优秀母畜的繁殖潜力,使母畜繁殖力提高几倍甚至10几倍,从而在短时间内迅速扩大优良种群,加速畜群改良和纯种繁育进程,也是迅速提高中国牛群整体水平的重要而有效的手段。近20年来,通过分割哺乳动物的早期胚胎来人工产生遗传上完全相同的同卵双胎或多胎动物,在绵羊、牛、小鼠、大鼠、马、兔、猪等哺乳动物中已广为开展,为生产上提供了具有优良品种(产肉、产奶量高等)的动物。早在1959年,Tarkowski发现一半卵裂球已被破坏的2-细胞小鼠胚胎可以发育成囊胚,并出生了小鼠。1980年,Willadsen用琼脂包埋分割的绵羊2、4、8-细胞期胚胎,使半胚在中间受体内发育时受到保护,并防止其内的卵裂球分散,取得了近似正常的妊娠率(66%)。但此方法较复杂,很难在生产上推广应用。1984年改进了方法,分割较晚期的胚胎(桑葚胚或胚泡),分割后的胚胎立即移植,因而具有很大的实用价值。近年来,科学家们仍在寻求更加简便、完善的胚胎分割和培养方法,以提高胚胎分割的效率。在哺乳动物尤其是大型农场动物进行良种繁殖时,可用胚胎分割方式增加胚胎数目及人造同卵双胎和多胎数目,移植后便可获得更多的良种。目前,在家畜特别是经济价值较高的牛中,胚胎分割已成为常规技术在商业胚胎移植中应用,增加胚胎数目,移植后获得更多的良种。集成胚胎移植相关环节技术和胚胎分割技术,用于发展德系西门塔尔牛基础母牛群,目的是加快德系西门塔尔牛的繁育速度,在短时间内迅速扩繁德系西门塔尔牛核心群,现把有关方法和结果报告如下。1材料方法1.1时间和地点2009年5月—2010年2月于河北省张北县华田牧业科技有限公司进行。此期间共冲胚4次,移植6次。1.2受影响的牛供体牛为健康,无生殖和传染性疾病,营养状况较好的纯种德系西门塔尔牛13头。受体牛为本地黄牛,营养状况良好,无生殖和传染性疾病。1.3药物和机器试验所需药品及仪器与耗材见表1和表2。1.4fsh的肌肉注射超排处理方案:在发情周期的任何一天上午给供体牛放置(CIDR+土霉素粉),同时肌肉注射维生素ADE注射液10mL/头,当日为第0天。从第5天上午开始到第8天下午,分别在每天上午7:00和下午7:00分2次,递减注射FSH,总剂量10mg。在第5、6次注射FSH的同时肌肉注射PGF2α0.6mg/头。第8天上午撤拴,并且用0.9%的生理盐水冲洗阴道,下午注射维生素ADE注射液10mL/头。第9天开始观察发情,并做好记录,发情后12h配种同时肌肉注射促排3号25μg/头,24h第2次配种。配种后7天冲胚。1.5pgf20.6.6m受体同期发情处理的方法(CIDR+PG法):受体牛发情周期的任何一天上午放CIDR,并肌肉注射维生素ADE5mL/头,记为第0天,第9天上午7:00注射PGF2α0.6mg/头,并肌肉注射维生素ADE5mL/头,第12天上午7:00撤去CIDR,第13天观察发情并做好记录,第21天移植。1.6显微手术刀的制备采用显微操作仪进行胚胎分割。(1)调节显微手术刀:使刀面垂直于分割皿底面,刀刃线与分割皿底面接近平行,刀尖略低。(2)清洗消毒显微手术刀:用4个φ35mm培养皿分别加入超纯水、95%乙醇、超纯水、胚胎分割液(Splitting),每次分割胚胎前按顺序清洗显微手术刀1遍。(3)待分割胚胎的准备:在φ60mm培养皿的盖或底上做分割液滴(50~70μL),将枚胚胎从Holding液中取出,在胚胎分割液中洗2~3次后放入分割液滴中,准备分割。(4)胚胎分割和回收:将显微手术刀的尖端部置于欲分割的胚胎上面,以刀尖刚探出胚胎为宜,对准胚胎的正中平分线徐徐下压,即可将1个胚胎分割成两半((1)最好选用桑葚胚胎或早期囊胚;(2)分割时,切不可将显微手术刀迅速压下以免损伤胚胎)。分割后的胚胎用吸有Holding液的吸管进行回收,并让分割后胚胎进行恢复,待移植使用。1.7保证了体外受精神质的保证直肠检查发情后7~8天的受体,选择黄体发育良好的受体牛进行移植;胚胎装管采用4段法,操作室温度控制在25℃左右,将胚胎移植到有黄体的一侧子宫角,并保证胚胎发育阶段与受体牛发情周期的同步性。双半胚移植是将一对半胚同时移植到有黄体的一侧子宫角,方法与单胚移植相同。胚胎移植后70~90天采用直肠检查法对受体牛进行妊娠检查。1.8数据计数平均回收胚数、平均可用胚数、平均退化胚数与平均未受精卵数采用SPSS15进行方差分析;移植妊娠率、流产死胎率采用χ2分析。2结果与分析2.1冷冻胚胎和鲜胚移植2009年5月1日—10月20日,13头20月龄德系西门塔尔供体牛经过4次超排处理获得胚胎654枚(头均50.31枚),其中可用胚胎335枚(头均25.77),4次共冷冻胚胎174枚,移植鲜胚161枚。供体牛4次超排有效率均为100%,平均可用胚数第4次最高(8.50枚),第2次最低(6.00枚),但各组间差异不显著(P>0.05),见表3。2.2半胚与鲜双半胚妊娠率比较从2009年5月—2010年2月共处理受体牛385头次,移植278头次(见表4),受体利用率为72.21%(鲜胚移植115头,冻胚移植118头,双半胚移植45头),妊娠153头,妊娠率55.04%,共获得犊牛137头。其中鲜双半胚和鲜胚移植妊娠率显著高于冻胚(64.44%,60.87%vs45.76%)(P<0.05),以鲜双半胚妊娠率最高。鲜双半胚的流产死胎率为37.93%,显著高于冻胚流产死胎率7.41%(P<0.01)和鲜胚流产率17.14%(P<0.05)。45枚鲜胚二分后移植到45头受体牛,29头妊娠,其中11头产双胎,双犊率为37.93%(11/29),存活犊牛29头。3受体牛超排、妊娠率高国内外目前还没有胚胎移植技术在德系西门塔尔牛应用的报道。赵鑫等报道西门塔尔母牛经过1个情期的生殖与体况的恢复,其卵巢机能基本恢复到超排前的状态,重复超排是可行的。在表3中,前3次供体牛重复超排获得的平均可用胚胎数(7.46枚、6.00枚、7.08枚)无显著差异(P>0.05),结果表明(CIDR+PG)法对德系西门塔尔牛重复超排可行,且能获得较好的超排效果。有研究报道,根据前1次超排效果有选择性地对供体牛进行重复超排可以获得稳定的超排效果,有效地提高供体牛利用率,降低胚胎生产成本。因此,综合考虑供体牛的繁殖状况和前3次的冲胚效果,5头供体牛在第4次未进行超排处理,表3结果显示第4次平均可用胚数最高(8.50枚),超排有效率仍为100%,与前3次均无显著差异(P>0.05)。结果验证了选择性对供体牛重复超排是一种提高供体牛利用率,降低胚胎生产成本的有效方法。采用(CIDR+PG)法对受体牛同期发情处理,受体利用率为72.21%(278/385),结果与赵智勇等报道的相同。表4中,鲜双半胚和鲜胚移植妊娠率显著高于冻胚(64.44%,60.87%vs45.76%)(P<0.05),以鲜双半胚妊娠率最高,这与吴柱月等、魏建生等报道结果相似。采用直接分割法,分割成活率达100%,获得的双半胚较单一全胚移植妊娠率高,主要是因2枚半胚有较多的滋养层细胞发育,增强了妊娠识别信号,为胚胎存活奠定了基础。表4中45枚鲜胚二分后移植到45头受体牛,29头妊娠,其中11头产双胎,双犊率为37.93%(11/29),存活犊牛29头,半胚产犊率为32.22%(29/90)。若按未分割的整胚计算,产犊率提高到64.44%(29/45),比整鲜胚移植的产犊率50.43%(58/115)提高14.01个百分点,结果与桑润滋等研究报道一致。据报道,怀双胎的母牛更需要较高的营养水平以满足胎儿的生长发育,否则胎儿因得不到足够的营养,而造成怀孕母牛流产。表4中,鲜双半胚的流产死胎率为37.93%,显著高于冻胚流产死胎率7.41%(P<0.01)和鲜胚流产率17.14%(P<0.05)。因此,此次鲜双半胚流产率较高的原因是否由于饲养管理模式没有根据受体牛移植情况及时调整而造成,还有待进一步研究。也有研究报道,西门塔尔牛属中大型牛,受体牛应选择体形较大的的杂交牛会比本地牛产犊效果好。4项目的繁殖效果2009年5月—2010年2月,13头德系西门塔尔牛共获得可用胚胎335枚,头均达到了25.77枚,移植受体移植278头次(其中双半胚移植45头),截止到2010年11月共获得犊牛137头。