野生杜鹃愈伤培养基的培养

野生杜鹃愈伤培养基的培养

杜鹃花是中国的传统花之一。它也是世界著名的观赏花卉，被称为木本花之王。杜鹃花是一个大属,全世界约有900余种,分布于欧洲、亚洲和北美洲,而以亚洲最多,有850种,其中我国有530余种,占全世界种类的59%,特别集中于云南、西藏和四川三省区的横断山脉一带,是全世界杜鹃花的发祥地和分布中心。杜鹃种子极小,播种繁殖困难。另外,由于杜鹃花是典型的嗜酸性植物,且自然界中缺乏耐碱的杜鹃种质资源,因此很难通过常规杂交育种方法获得耐碱品种,这些原因极大限制了杜鹃花的开发和利用。通过植物组织培养技术可以实现杜鹃花的快速繁殖,这对保护名贵杜鹃的种质资源具有重要意义。1材料和方法1.1叶片离体培养由日照五莲山采取的野生杜鹃花(Rhododendronsimsii)种子在无菌条件下发芽获得试管苗,然后用无菌苗的叶片进行离体培养研究。1.2测试方法1.2.1创建吐温80in先用20mg/L的GA3处理杜鹃花种子12h后,再用75%的酒精(每100ml酒精中添加1ml灭菌的吐温80)浸泡3min,尽可能多的去掉较大杂物。然后在超净台上用0.1%的升汞消毒8min,再用10%的次氯酸钠消毒10min,最后用无菌水冲洗3～4遍,用无菌枪头接种到不含激素的1/4Anderson培养上。1.2.2诱导愈伤的检测(1)种子接种在1/4Anderson培养基上,无菌发芽得到试管苗。(2)当年采取的种子大约7天开始萌发,1月后即可使用。摘取试管苗叶片切伤后接种到附加不同浓度的TDZ、ZT、2,4-D、NAA的1/4Anderson上,筛选出诱导愈伤的最佳激素配合比。每瓶20块,重复5次,2周后统计愈伤诱导率。(3)芽诱导:将愈伤组织接种到含不同浓度的TDZ、2-IP、ZT、IBA的1/4Anderson培养基上,每瓶20块,重复5次。2周后统计芽分化率及愈伤组织块上芽体数。(4)生根培养:用不添加任何激素的1/4Anderson培养基进行4周壮芽培养后,将试管芽分别接种到不同配方的生根培养基中。4周后观察生根情况,并统计生根结果,从中筛选出最佳生根培养基。(5)培养条件:培养温度(25±2)℃,光照时间12h/d,光照强度2000～3000lx。蔗糖30g/L,pH4.8,琼脂粉5g/L。2结果与分析2.1愈伤诱导培养基从表1中可以看出,附加不同激素的愈伤组织诱导培养基对愈伤组织诱导效果完全不同。我们进行组织培养的目的是为了实现杜鹃花快速繁殖,愈伤组织的好坏、多少决定了不定芽的质量。因此,我们要获得最佳愈伤诱导培养基。上表结果表明:2,4-D1mg/L+TDZ0.1mg/L为最佳愈伤诱导培养基。TDZ、ZT浓度低时诱导愈伤效果好,浓度提高或降低都会使愈伤率降低,愈伤块生长状况改变。高浓度的2,4-D与NAA使愈伤生长缓慢,并且降低了愈伤诱导率,加速了细胞老化。2.2-ip对愈伤组织增殖的影响为获得大量不定芽,需要足够的愈伤组织块,因此在不定芽诱导前,我们进行了愈伤组织的继代增殖。愈伤组织增殖培养基与诱导培养基相同。表2结果表明,TDZ浓度对不定芽的再生率有显著影响,而2-IP可增加单个愈伤块上的芽体数目。ZT在芽诱导过程中,需要较高浓度,这可能会导致芽苗玻璃化。因此我们在芽诱导过程中细胞分裂素多采用TDZ与2-IP,生长素则选用活性较低的IBA。2.3生根数降低不同激素对再生芽的生根率、生根数目影响程度不同。当IBA浓度低于2mg/L时,再生芽的生根率及生根数与IBA浓度呈正相关;IBA浓度如果继续增加,生根率及生根数都会降低。此外,培养基中NAA浓度对再生芽的生根率也有显著影响,当NAA浓度低于0.1mg/L时可有效促进生根;如果再增加NAA浓度,生根率明显降低,当NAA浓度为0.5mg/L时,在根部则会出现明显愈伤。另外,在NAA0.1mg/L的培养基上进一步对蔗糖(10g/L、20g/L、30g/L),活性炭(2g/L、4g/L、6g/L)筛选,结果表明蔗糖浓度与活性炭浓度对生根影响不大,但低浓度的活性炭可使芽苗健壮,叶片深绿。3生根培养基的使用3.1经过以上试验发现杜鹃花叶片诱导愈伤的最佳培养基为1/4Anderson+2,4-D1mg/L+TDZ0.1mg/L;芽诱导培养基是1/4Anderson+IBA0.1mg/L+TDZ1mg/L+2-IP0.5mg/L;生根培养基是1/4Anderson+NAA0.1mg/L。3.2植物生长调节剂在植物组织培养中起着重要而显明的作用。生长素能够诱导细胞分裂,促进细胞伸长,一般低浓度的生长素可促进生长,而浓度较高则会抑制植物生长;细胞分裂素主要是促进细胞分裂,诱导芽的形成和促进芽的生长。因此适当的激素配比有利于愈伤组织的诱导,不定芽的分化以及不定根的形成。3.3采用二步法诱导不定芽,在愈伤增殖阶段,愈伤增殖代数不宜过多,过多继代增殖会导致芽诱导率显著下降,一