疏肝理气法对实验性功能性消化不良大鼠下丘脑和胃窦胃泌素、生长抑素表达的影响

疏肝理气法对实验性功能性消化不良大鼠下丘脑和胃窦胃泌素、生长抑素表达的影响

功能障碍（fd）是最常见的消化疾病。大量的文献报道及临床实践显示,中医疏肝理气法为主治疗本病具有较好效果,其作用可能与促胃动力有关,但其确切机制尚不清楚。本实验通过夹尾激惹刺激法制造FD大鼠模型,观察柴胡疏肝散对其下丘脑和胃窦胃泌素、生长抑素表达的影响,以期从中枢及外周脑肠肽角度探讨疏肝理气法治疗消化不良的作用机制。1动物模型的制作清洁级8周龄雌性Wistar大鼠32只,体重(180±20)g(广西医科大学实验动物中心提供)。大鼠随机分成正常对照组、模型组、柴胡疏肝散组,吗丁啉组,每组8只。除正常组外,其余各组参照根据文献加以改进,采用夹尾激惹刺激法制造FD大鼠模型,方法是束缚布包止血钳钳夹标记鼠鼠尾,立即放开,每次30min,每天2次,持续3周。经典原方柴胡疏肝散由柴胡、白芍、枳壳、川芎、香附、甘草组成,将以上药物按成人(60㎏)临床用药量的10倍,按1∶5容积比,用蒸馏水浸泡30min,煎煮2次(30min/次)后,过滤,去渣取汁,合并滤液加热蒸发,制成141%水煎浓缩液(每毫升含生药1.41g),4℃保存待用。吗丁啉(西安杨森制药有限公司,10mg/片),临用时加蒸馏水制成0.2g·L-1的溶液。生长抑素免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;胃泌素免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒、柠檬酸抗原修复液、PBS缓冲液均购自福建迈新生物工程公司。2免疫组化染色32只大鼠适应性喂养1周后,于造模同一天开始灌胃,正常组和模型组分别予0.9%NaCl溶液灌喂(每100g体重予1.5mL),柴胡疏肝散组、吗丁啉组分别予柴胡疏肝散水煎液、吗丁啉溶液灌胃,每100g体重每次1.5mL,早晚各1次。共喂药3周。处死大鼠前禁食不禁水24h,在试验第22d,所有大鼠用3%戊巴比妥钠(每200g体重1mL)腹腔麻醉,剖腹取胃,断头取脑。10%福尔马林固定,常规包埋,切片,免疫组化检测用。采用SP法进行免疫组织化学染色,操作按照试剂盒说明书进行,鼠抗GAS单克隆抗体,工作浓度为1:100;兔抗SS多克隆抗体,工作浓度为1∶150。以PBS代替一抗作为阴性对照。以试剂公司提供的阳性对照片作为阳性对照。光镜下观察阳性染色细胞定位。以胞浆或胞膜出现棕黄色至深棕黄色颗粒为阳性结果。以病理图像分析系统采图并进行图像分析,表达水平以面积密度(areadensity,AD)表示.所有数据均经SSPS13.0统计软件处理,并以x¯±sx¯±s表示,采用单因素方差分析。P<0.05显示有统计学意义。3对胃窦和胃窦gas表达的影响GAS在下丘脑主要表达在神经元细胞的胞浆,呈椭圆、三角形或多边形棕黄色颗粒,在胃窦主要表达在黏膜层的上皮细胞的胞浆中,呈圆形或椭圆形棕色颗粒,2个部位均以正常组GAS阳性细胞分布较多,吗丁啉组、模型组GAS阳性细胞在下丘脑分布较少,柴胡疏肝散组GAS阳性细胞较二者增多;在胃窦中模型组较少,柴胡疏肝散组和吗丁啉组较模型组增多。SS在下丘脑定位于神经元细胞的胞膜和(或)胞浆上,在胃窦中,SS主要表达在黏膜层的上皮细胞的胞浆中,呈圆形或椭圆形棕褐色颗粒。模型组下丘脑和胃窦SS阳性细胞较正常对照组增多,吗丁啉组和柴胡疏肝散组下丘脑SS阳性细胞与模型组无明显差别,而在胃窦中的阳性细胞较模型组减少(图1～8)。与正常组比较,模型组下丘脑和胃窦GAS表达显著减弱(P<0.01);柴胡疏肝散组下丘脑和胃窦GAS表达均较模型组显著增强(P<0.05,P<0.01),吗丁啉组胃窦GAS表达亦较模型组显著增强(P<0.01),吗丁啉组下丘脑GAS表达则和模型组无显著差异。与正常组比较,模型组下丘脑和胃窦SS表达显著增强(P<0.01);柴胡疏肝散组和吗丁啉组胃窦中SS均较模型组显著下降(P<0.01),柴胡疏肝散组和吗丁啉组下丘脑SS表达则和模型组无显著差异(表1)。3胡萝卜干粉对fd大鼠脑肠肽和ss的调治作用脑肠肽不仅通过体液途径或作为肠道神经系统的递质在外周对胃肠运动功能进行调节,还可通过影响迷走神经环路在中枢水平发挥作用,表明在体内内分泌和神经2个调节系统,可能作为一个统一的整合系统——神经内分泌系统而起作用。而中医认为,肝主疏泄,具有调理气机,调畅情志,助脾胃运化,通利气血的作用,这相当于西医的神经-内分泌-消化系统等部分的功能集合。可以认为中医肝主疏泄理论与西医脑肠肽理论可以说某种程度上是异曲同工,殊途同归,均注重有机整体,相互关照,中医“肝主疏泄”的功能可能是调节脑肠肽的核心,疏肝为主方药能调节FD胃组织或外周血水平。本研究选取的SS和GAS是2种典型的脑肠肽,它们双重分布于中枢神经系统和消化道。SS在中枢神经系统,主要存在于下丘脑,在消化系统,主要分布于肠神经系统、胃体和胃窦黏膜内的D细胞中,其可抑制多种胃肠激素如GAS、胃动素和胆囊收缩素等的分泌和释放,抑制胰腺的外分泌和胆汁分泌,抑制胃肠运动和胆囊收缩。下丘脑是自主神经的皮质下中枢,也是情感的皮质下中枢,SS水平与抑郁严重度呈明显负相关,即抑郁越严重,SS水平越低,有些学者认为SS是抑郁症的一个状态标志。胃泌素主要由胃窦及十二指肠黏膜的G细胞分泌,另外人胰岛的D细胞也有分泌,在中枢神经系统下丘脑、延髓的迷走神经背核也含有胃泌素。其生理作用为促进胃酸分泌、使胃窦和幽门括约肌收缩,延缓胃排空。本实验选用慢性“夹尾刺激法”复制FD模型,从适度的慢性躯体刺激引发心理应激,能较好的模拟FD病人抑郁和消化吸收功能减退等的临床特点。本研究结果显示,在下丘脑,SS定位于神经元细胞的胞膜和(或)胞浆上,而GAS则主要表达在神经元细胞的胞浆,在胃窦中,GAS、SS主要表达在黏膜层上皮细胞的胞浆中。有研究发现,在人体,多巴胺可能是通过改变肽类激素水平,从而影响消化间期胃肠运动,为此本研究选择吗丁啉为对照组,观察了柴胡疏肝散对FD大鼠下丘脑和胃窦GAS、SS表达的影响,结果发现,柴胡疏肝散能显著上调FD大鼠胃窦GAS蛋白表达,下调胃窦SS蛋白表达,作用与吗丁啉相当,提示柴胡疏肝散与吗丁啉一样具有调节FD外周胃肠激素分泌紊乱的作用;吗丁啉对下丘脑的GAS和SS表达水平均无明显影响,这可能与其不能透过血脑屏障,在脑中几乎无分布有关;而柴胡疏肝散还能显著上调下丘脑GAS表达,但对下丘脑SS无明显影响,提示其在中枢水平对部分脑肠肽的作用,也提示其复方多靶点的整体调治作用。由此推测疏肝理气法能使得FD肝气正常升发,津血能正常为五脏六