疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞脂肪沉积的影响

疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞脂肪沉积的影响

非酒精性脂肪性肝病（nafd）是与遗传环境或代谢反应相关的临床病理综合征，其特点是没有饮酒过量的酒精历史、肝功能减退和脂质积累。包括个体肝炎、非酒精脂肪性肝炎、相关肝细胞癌、肝细胞癌等。大量研究表明:脂质代谢异常是NAFLD发病机制中最关键也是最基础的环节之一。近年来,随着核受体调节胆固醇和脂肪代谢途径的发现,核受体对肝细胞内脂质平衡机制的研究也逐渐成为研究的热点。有研究表明:LXR/FAS通路是调控肝细胞脂肪代谢平衡的重要通路之一,通过对肝细胞的脂肪代谢平衡的影响,进而影响肝细胞脂肪的沉积。由于NAFLD发病机制尚不明确,目前缺乏最有效和适当的药物治疗NAFLD,传统中医药能够温和而有效的治疗NAFLD已经得到循证医学的证实。但中药的意义在于通过由特定活性物质群介导的多靶点、多途径整合作用发挥方证对应的终末效应,在前期研究发现疏肝健脾方药具有降低NAFLD大鼠肝组织的LXRα、FAS基因和蛋白表达,改善脂质代谢紊乱,减轻脂肪沉积的效果。本实验在既往研究的基础上,运用疏肝健脾方药对LXRα/FAS信号通路介导NAFLD大鼠肝细胞脂肪沉积的影响进行研究,旨在从细胞水平进一步探讨疏肝健脾方药防治NAFLD的机制,为NAFLD的中医药治疗提供实验室依据。材料和方法1医药大学实验动物中心SPF级雄性SD大鼠75只,体重(200±20)g,购于广州中医药大学实验动物中心,实验动物批号:0107792,使用许可证号:SCXK(粤)2008-0020;饲养于暨南大学实验动物管理中心SPF级动物房内,使用许可证号:SYXK(粤)2012-0117。2试剂和机器2.1dna酶、epta和trizel核酸提取液Nycodenz(挪威Axis-Shield公司),Ⅳ型胶原酶、RPMI-1640培养基为(美国GIBCO公司),蛋白酶E(德国Roche公司),Hepes(美国Amresco公司),DNA酶Ⅰ、EGTA(美国Sigma公司)。TRIzol核酸提取液(美国Invitrogen公司产品);逆转录试剂盒(日本TOYOBO公司))。核蛋白提取试剂盒和蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。Anti-LXRα(美国Abcam公司),Anti-FAS(美国Abcam公司),QuantcDNA第一链合成试剂盒、SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)。高脂饲料配方:基础饲料88%,猪油10%,胆固醇1.5%,胆盐0.5%;该饲料由南方医科大学实验动物中心加工,广州市华大辐照中心钴60照射灭菌(辐照剂量25.0kGy)。2.2co培养箱美国a冰冻切片机(德国Leica公司);AU600全自动生化分析仪(日本Olympus公司);超净工作台(苏州净化设备有限公司);CO2培养箱(美国Thermo公司);PCT-200型梯度PCR仪(美国BIO-RAD公司);Chromo4实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司);悬垂式冷冻离心机(美国Thermo公司);倒置相差显微镜(德国Leica公司);ELITE流式细胞仪(美国Beckman-coulter公司);凝胶成像系统(中国AUTEL公司)。3高脂饲料的制备SD大鼠75只适应性饲养1周后,采用随机数字表法分为5组,分别为:正常组、模型组、疏肝组、健脾组及合方组(柴胡疏肝散联合参苓白术散),每组15只。模型建立采用改进后的课题组前期实验方法:正常组大鼠给予维持饲料喂养,其余各组均以高脂饲料喂养高脂饲料,喂养时间为8周。在造模同时,各组按10mL/kg给予相应的药物或超纯水灌胃干预,分别为疏肝组:柴胡疏肝散(柴胡6g芍药5g枳壳5g川芎5g香附5g陈皮6g炙甘草3g)9.6g/kg;健脾组:参苓白术散(人参15g茯苓15g白术15g白扁豆12g薏苡仁9g砂仁6g山药15g桔梗6g莲子9g炙甘草9g)30g/kg;合方组:柴胡疏肝散联合参苓白术散合方,39.6g/kg。上述实验药物均为中药配方免煎颗粒剂,由深圳华润三九医药股份有限公司生产,购于暨南大学附属第一医院中药房,组成、剂量均参考方剂学,剂量为人临床等效剂量的3倍用量。正常组和模型组分别给予相应体积的超纯水。4指标和方法的检测4.1肝组织病理学检测8周后,每组取9只大鼠,腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,采集右叶1.5cm×1cm×0.5cm肝组织,油红O染色观察肝组织病理变化。4.2肝组织匀浆的制备取各组大鼠右叶1cm×1cm×1cm肝组织,加入异丙醇溶液中,进行肝组织匀浆,后取上清。全自动生化分析仪检测各组肝组织TC、TG含量。4.3分离所获从细胞培养液中培养的企业各细胞具体方法在前期细胞分离与鉴定的基础上加以改进,以RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)10mL,在无菌培养皿中,撕开肝包膜,使细胞悬液流出,剪碎未完全消化的肝组织。细胞悬液分别经200目及300目细胞筛网,GBSS液垂悬,108r/min离心3min,共2次,4℃离心。离心沉淀物加GBSS液垂悬,108r/min离心3min,共2次,4℃离心洗涤,10%RPMI-1640培养基垂悬所得沉淀,取悬液9∶1染色进行细胞计数,细胞终浓度调整为2~5×106个/mL,此即为分离所获肝细胞,接种于细胞培养瓶,置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。95%肝细胞在培养12h后,可以贴壁,洗去未贴壁的细胞,更换培养基,即得到纯化后的肝细胞。胰酶消化细胞后,PBS洗涤两次,固定剂固定15min,离心去上清后,加入破膜试剂,两种细胞分别加入一抗(兔抗大鼠ck-18和Lysozyme),室温孵育30min,加入二抗(羊抗兔IgG-FITC)室温孵育30min,破膜试剂洗涤两次后,上机检测。4.4引物的设计与合成采用TRIzol常规一步法提取肝细胞RNA,测定RNA样品含量及纯度,然后逆转录为cD-NA。GeneBANK中查找到大鼠GAPDH内参和LXRα、FASmRNA序列。引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计并合成(见表1)。PCR按照试剂盒说明书进行操作,采用10μL反应体系。反应条件:(1)95℃持续1min预变性;(2)95℃持续10s变性;(3)GAPDH57.5℃,LXRα54℃,FAS54℃,退火20s;(4)68℃持续30s延伸,(2)~(4)39个循环;(5)溶解曲线分析,72~95℃,持续5~10s。反应完毕,采用OpticonMonitor3.1软件分析,用公式2-△△Ct方法进行相对定量。4.5蛋白含量和洗养液制备取1mL的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mmol/L。计数新鲜分离的细胞,按照5~10×106个细胞加入1mLRIPA裂解液,4℃,14000r/min离心5~10min,蛋白含量的测定,根据碧云天BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。然后转移至PVDF膜上,加5%脱脂奶粉封闭液,室温下平摇1h;洗膜,加一抗稀释液(LXRα1∶5000,FAS1∶2000),4℃过夜孵育;洗膜,加二抗稀释液(1∶6000~8000)室温孵育1h,洗膜后,进行化学发光反应。曝光、显影、定影,最后对结果进行光密度扫描分析。5统计学处理方法用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料以ue0af±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析(SNK法),P<0.05为差异有统计学意义。对nafld大鼠肝组织血脂表达的影响正常组大鼠肝细胞核呈淡蓝染色,少许肝细胞胞浆内可见散在的红染脂滴。模型组大鼠肝细胞肿胀,细胞核呈深蓝染色,细胞浆可见大量红色脂滴,少许肝细胞脂滴融合成大脂滴。各用药组大鼠肝细胞脂滴含量介于正常组与模型组之间,其中以疏肝组大鼠肝细胞脂滴含量与正常组最为接近,提示疏肝组方药减少NAFLD大鼠脂肪沉积疗效较好。与正常组比较,模型组大鼠肝组织TC、TG含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,疏肝组大鼠肝组织TC、TG含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各用药组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。每只NAFLD大鼠获得纯化后肝细胞为6.0~7.5×108个/肝。取少量2种细胞,胰酶消化,行台盼蓝染色,倒置相差显微镜细胞计数,测定其活力,肝细胞在95%以上。新鲜刚分离获得的肝细胞透亮、呈圆形或球形,折光性强,边界清晰;12h后细胞透亮、呈圆形或椭圆形、边缘伸展。FCM鉴定肝细胞:共检测细胞10000个,CK-18受体表达的细胞共9322个,占所有细胞比例为93.22%,即肝细胞纯度为93.22%。与正常组比较,模型组肝细胞LXRα、FASmRNA表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.01),分别为正常组的13.08和22.63倍;与模型组比较,各用药组肝细胞LXRαmRNA均有不同程度下降(P<0.01,P<0.05),其中以疏肝组下降明显,与健脾组比较,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。5比较两组大学生的统计学效果与正常组比较,模型组LXRα、FAS蛋白表达均有明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,各用药组LXRα、FAS蛋白表达均有不同程度下降(P<0.01)。lxr和fas基因表达NAFLD的最典型特征是肝脏脂肪积聚,各种原因引起肝脏内脂质代谢自稳的破坏致使脂质在肝细胞异常沉积,而肝内脂肪沉积又是代谢紊乱的启动因素,当肝细胞异常脂质沉积到一定程度,可导致肝细胞内脂质动态平衡紊乱,进而加重NAFLD的脂质代谢。本研究中模型组NAFLD大鼠肝脂含量较正常组存在非常显著性差异(P<0.01),说明NAFLD大鼠肝脏中存在大量脂肪沉积,出现了较为明显的脂质代谢紊乱。而油红O染色进一步证实了肝细胞存在明显的脂肪沉积,也证实了NAFLD模型组大鼠肝细胞存在明显脂肪变性和脂肪沉积。肝细胞脂质平衡受到多条信号途径共同调控和影响,核受体对肝细胞内脂质平衡机制的研究也日趋增多。本实验研究了核受体LXRα与靶基因FAS结合对肝细胞脂肪酸的生成进行调节,从而影响脂肪的合成。LXRα是脂肪酸生成的一些关键酶的基因,其中FAS是它的下游基因,LXR对于脂肪合成的关键酶FAS的调节,既可以是通过直接与FAS启动子结合,又可以间接通过SREBP-1C途径上调FAS基因表达来实现。SREBP-1C的过度表达可引起FAS基因转录增加,从而导致FAS活性的增强,并引起脂肪酸合成增多和增加,在肝细胞中异常沉积形成脂肪肝。在缺失LXR基因的小鼠体内,肝SREBP-1C的mRNA基础表达水平显著下降,与之相平行的是受SREBP-1C调控的FASmRNA水平显著下降。本研究结果表明,NAFLD模型组较正常组肝细胞LXRα、FAS基因及蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01),这个结果与上述研究结果相一致,结合油红O染色和肝脂的结果可见:LXRα/FAS信号通路介导NAFLD大鼠肝细胞脂肪沉积,导致肝细胞脂质平衡紊乱。但其具体机制尚待进一步研究,或许与LXRα/FAS信号通路导致内质网应激相关。脂肪肝属于中医古代“胁痛”、“肝著”、“肝痞”等病范畴,但无明显对应关系。前期研究表明认为肝郁脾虚是NAFLD发生发展的基本病机,疏肝健脾治法当贯穿疾病全程。由于脂质属于精微物质的范畴,机体内的精微物质是在不断地化生、转运、转化和代谢的,处于一种动态平衡中,这一平衡,有赖于脾主运化与肝主疏泄功能,二者相互协调、相互为用维持动态平衡,维持脂质代谢自稳态,一旦肝郁脾虚则脂质代谢自稳态出现紊乱,导致NAFLD的发生发展。疏肝健脾方药主要由中医传统名方柴胡疏肝散、参苓白术散组成,主要针对肝郁脾虚的病机。现代研究表明:柴胡疏肝散及参苓白术散的主要活性成分包括:阿魏酸、人参皂苷、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮内酯、新橙皮苷、芍药内酯苷和白术苷等药物成分组成,其中人参皂苷、白术苷等成分可能具有降低脂的效果。在本次研究中疏肝健脾方药具有显著改善肝细胞脂肪沉积,降低肝脂的效果,但以疏肝组疗效最为显著,