注射液无菌检查的方法学验证方案

注射液无菌检查方法（中国药典2010版）验证方案验证方案编号：2010•MEF•041•05•004起草单位(Composedby)：质检部(QCDepartment)起草人(Composer)：日期(Date)：审核人(ReviewedbyQC)：日期(Date)：审核人(ReviewedbyQA)：日期(Date)：批准人(Approvedby)：日期(Date)：目录1.验证目的2.验证人员3.验证依据及参考文件4.仪器与设备5.验证过程5.1培养基及稀释液5.2菌液的培养与制备5.3方法验证试验6.验证总结

1.验证目的：本试验是注射液的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查方法的可靠性进行验证，以确认该产品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可以忽略。即：保证所用的无菌检验方法能对该产品进行准确、可靠的检验。2.验证人员：验证小组组长：刘长宏验证小组副组长：宋芳良验证小组成员：曲晓燕、常西胜3.验证依据及参考文件：验证依据：中华人民共和国药典2010版二部参考文件：2010年版中国药典无菌检查方法、验证操作学习班讲稿汇编（中国药品检验所）4.仪器与设备XG1.DM-0.36B型机动门脉冲真空灭菌器细菌培养箱霉菌培养箱净化工作台5.验证过程：5.1培养基及稀释液5.1.1培养基及稀释液的配制按“中国药典2010版二部附录ⅪH无菌检查法”中，有关规定配制本验证所需培养基:名称来源生产批号配制批号硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基0.1％蛋白胨溶液0.9％无菌NaCl溶液改良马丁琼脂培养基5.1.2培养基的适用性检验5.1.2.1培养基无菌性检查从以上培养基及稀释液中，每批随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。结果记录：名称1＃2＃3＃4＃5＃结果硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基营养肉汤培养基营养琼脂培养基0.1％蛋白胨溶液0.9％无菌NaCl溶液改良马丁琼脂培养基注：无菌生长记为“－”；有菌生长记为“＋”结论：5.1.2.2培养基灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果。取每支装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则可判该培养基的灵敏度检查符合规定。硫乙醇酸盐流体培养基批号:菌液名称第一天第二天第三天金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌空白对照注：无菌生长记为“－”；有菌生长且生长良好记为“＋”；有菌生长但生长较差记为“差”。改良马丁培养基批号:菌液名称第1天第2天第3天第4天第5天白色念珠菌黑曲霉空白对照注：无菌生长记为“－”；有菌生长且生长良好记为“＋”；有菌生长但生长较差记为“差”。结论：5.2菌液的培养与制备5.2.1菌种菌种名称编号批号代数金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003铜绿假单胞菌CMCC（B）10104枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501生孢梭菌CMCC（B）64941白色念珠菌CMCC（F）98001黑曲霉CMCC（F）980035.2.2菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取肉汤培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。用营养琼脂培养基做活菌计数备用。接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9％无菌NaCl溶液稀释至10－5～10－7稀释级制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23~28℃培养24~48小时。用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取改良马丁培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。取培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液（含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80）十倍稀释至10－4稀释级可得约为50～100cfu/ml的孢子悬液。用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。菌液制备后在常温下放置，并在2小时内使用。若保存在2-8℃

菌种名称试验次数培养温度℃培养时间/小时稀释度活菌计数结果cfu/ml空白对照平皿cfu/ml平皿1平皿2金黄色葡萄球菌130-3548h23铜绿假单胞菌130-3548h23枯草芽孢杆菌130-3548h23白色念珠菌123-2872h23黑曲霉123-2872h23生孢梭菌130-3548h23注：生孢梭菌只记录生长情况“正常”“异常”，不计数。结论：5.3方法验证试验按中国药典2010版二部规定，根据下表中预定检验方案，将规定量的注射液供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中分别加入小于100cfu的试验菌之一，过滤。取出滤膜接种至相应培养基中（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培养基中；白色念珠菌、黑曲霉接种于改良马丁培养基中）。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量的相应试验菌，作为对照。按规定温度培养3～5天，观察各试验管生长情况。各试验菌同法操作。

方法稀释液冲洗量产品名称薄膜过滤法0.1％蛋白胨溶液0ml苦参素氯化钠注射液、法莫替丁氯化钠注射液、胞磷胆碱钠氯化钠注射液、维生素C注射液、胞磷胆碱钠注射液、利巴韦林注射液、肌苷注射液、吡拉西坦注射液、曲克芦丁注射液、复方氨林巴比妥注射液、盐酸奈福泮注射液、酚磺乙胺注射液、苦参素注射液、氢化可的松注射液、尼莫地平注射液、维生素B6注射液、葡萄糖酸锑钠注射液、盐酸曲马多注射液、甲硫胺酸VB1注射液、乙酰胺注射液、盐酸曲马多氯化钠注射液、磷酸川芎嗪注射液、盐酸纳洛酮注射液、果糖二磷酸钠注射液100ml地塞米松注射液800ml克林霉素磷酸酯注射液、硫酸小诺霉素注射液、硫酸妥布霉素注射液、硫酸阿米卡星注射液、硫酸庆大霉素注射液、盐酸林可霉素注射液、硫酸奈替米星注射液PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液---无直接接种法无与对照管（只加阳性菌）相比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则该供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可以照此检查法进行该产品的日常无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则该供试品的该检验量在该试验条件下有抑菌作用，可逐一采用以下方法消除或减小该供试品的抑菌性并重新进行方法验证：（1）增加冲洗量（2）增加培养基的用量（3）使用中和剂或灭活剂（4）更换滤膜品种同法每个注射液产品至少平行测定三次。

第一次试验结果：品名：批号：规格：接种量：冲洗量：稀释液：菌种名称结果记录种类1天2天3天4天5天金黄色葡萄球菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）铜绿假单胞菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）枯草芽孢杆菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）生孢梭菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）白色念珠菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）黑曲霉供试品＋阳性菌阳性菌（对照）注：试验管无菌生长记为“－”；有菌生长且生长良好记为“＋”；有菌生长但生长情况较差记为“差”。第二次试验结果：品名：批号：规格：接种量：冲洗量：稀释液：菌种名称结果记录种类1天2天3天4天5天金黄色葡萄球菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）铜绿假单胞菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）枯草芽孢杆菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）生孢梭菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）白色念珠菌供试品＋阳性菌阳性菌（对照）黑曲霉供试品＋阳性菌阳性菌（对照）注：试验管无菌生长记为“－”；有菌生长且生长良好记为“＋”；有菌生长但生长情况较差记为“差”。

第三次试验结果：品名：批号：规格：接种量：冲洗量：稀释液：菌种名