拉米夫定在健康人体的药代动力学研究

拉米夫定在健康人体的药代动力学研究

拉米夫丁是英国格兰斯韦康公司开发和开发的一种慢性肝炎药物。它是山羊病毒逆转酶抑制剂。它的化学名字是2、3、双氧化氯仿3-硫醇基。临床上用于治疗慢性乙型肝炎感染。到目前为止,在世界范围内已有超过3000名慢性乙型肝炎病人接受过拉米夫定的药物治疗,超过80名健康受试者参加了I期临床研究。这些临床研究的结果显示,给予慢性乙型肝炎病人100mg拉米夫定,每日1次时疗效最好,故将此剂量定为临床应用的推荐剂量。为了了解拉米夫定在国人体内的药代动力学情况,我们测定了一组中国健康男女受试者在口服100mg拉米夫定后的药代动力学情况。材料和方法1.夫定标准品及内标拉米夫定100mg片剂(批号T97/169A)、拉米夫定标准品及内标carbovir均由英国葛兰素威康公司提供。BiositeTriageTM药盒,Merck公司产品。国产试剂乙腈、甲醇等为色谱纯,其余化学试剂均为分析纯。2.hplc测定本研究所用HPLC系统由Waters600E泵、Waters486紫外检测器、Waters712DWISP自动进样器、WatersTCM柱温箱以及WatersPC800积分软件组成。HPLC条件如下:色谱柱为hypersilC18柱(5μm粒径,25cm×4.6mm);测定血浆样品时流动相由8%甲醇、0.1%乙酸、1%乙腈溶于100mmol·L-1乙酸胺水溶液中组成,测定尿样品时流动相由10%甲醇、0.1%乙酸溶于100mmol·L-1乙酸胺水溶液中组成;流速为1.0ml·min-1;柱温50℃;检测波长270nm。3.研究对象的选择受试者的选择根据卫生部药政局发布的《新药临床研究指导原则汇编》中对药代动力学研究的技术要求进行,本研究选择了除孕妇、老年人、儿童外的健康志愿受试者24名,其中男性12人,女性12人。年龄在19～40岁之间。平均体重为58.2±10.0kg,平均身高1.66±8cm。所以志愿者在签署知情同意书以后,经病史、体检及实验室等检查正常后入选。4.试验设计采用开放、多次给药试验设计进行本项药代动力学研究。5.口服100.拉米夫定片整个试验期间所有受试者均留住于北京协和医院临床药理中心I期临床试验病房,无论是否由试验药物引起的任何药物不良反应均由医护人员记录、报告并及时处理。试验期间不能服用除扑热息痛外的任何药物,不能饮用可乐、茶等饮品,不能进行剧烈运动所有受试者入组后均在第次服药前夜及第7次服药后2周内再次进行体检(体温、血压、心率测定)及心电图检查,并在第7次服药后2周内进行血常规、尿常规及化验室检查。受试者每天口服100mg拉米夫定片一次,试验持续7d。试验前1d受试者禁食过夜。受试者于试验第1d清晨一次空腹口服100mg拉米夫定片及200ml水,并于服药前、后按设计时间点采集前臂静脉血6ml;取血1h后离心分出血清,保存于-70℃冰箱至测定。此外受试者需留0,0～12h,12～24h尿并记录尿量,然后各取10ml保存于-70℃冰箱至测定。受试者于服药后2h可饮用矿泉水、白开水,并于服药后4h进中餐、8h进少量零食、10h进晚餐。中、晚餐为统一清淡低次黄嘌呤标准餐。试验第7d,受试者重复试验第1d的采血过程,并按同样食谱在同样时间进食、进水。试验第2～6d,受试者每天清晨一次口服100mg拉米夫定片及200ml水。6.血液和尿液样本的测定6.1血液中拉米夫测定的测定6.1.1标准曲线的制作精密量取一定量空白血浆置50ml具塞试管中,分别加入拉米夫定标准溶液(10mg·L-1)配成0.01,0.02,0.05,0.2和1mg·L-1的标准曲线样品,然后按每份1.0ml将所配样品分装,贮存于-70℃冰箱备用。质控样品制备方法同上,拉米夫定浓度为0.02,0.1及0.8mg·L-1。6.1.2内标溶液的制备方法先将内标carbovir配成1g·L-1的水溶液,然后用1%乙酸稀释至0.75mg·L-1。6.1.3样品的制备和分离精密量取血浆样品1.0ml,置5ml试管中,精密加入内标溶液(750μg·L-1)1.0ml,充分振荡后转移至经2ml甲醇和2ml1%乙酸活化过的BondElutCertifyLRC(130mg,10ml)固相萃取柱(Varian,HarborCity,CA,USA),待上柱样品在真空吸引下滴干后,依次用2ml1%乙酸,2ml甲醇-10%乙酸液(9:1,v/v)及2ml去离子水淋洗萃取柱,并弃去淋洗液。最后用0.5ml甲醇-三乙胺液(99:1,v/v)连续洗脱4次并收集全部淋洗液至干净样品管,70℃下用氮气缓速吹干。残渣用200μl流动相溶解后,在HPLC条件下分离测定制备后的血浆样品,进样量100μl。记录色谱图及拉米夫定与内标的峰高比。6.1.4同对比和质控样品的制备同血浆样品的处理与测定。同一位受试者第1d和第7的血浆样品在同一批内测定每批样品包括一条标准曲线和6个均匀分布在待测样品中的质控样品(低、中、高三种浓度各2个)。6.1.5加标回收率测定分别于1ml空白血浆中加入不同量拉米夫定标准溶液配成从低至高4种浓度拉米夫定的血浆样品(0.01,0.02,0.05和1mg·L-1),按血浆样品的处理与测定方法操作,依法测定回收率。6.1.6精密度与准确度分别于1ml空白血浆中加入不同量拉米夫定标准溶液配成从低至高4种浓度拉米夫定的血浆样品(0.01,0.02,0.05和1mg·L-1),按血浆样品的处理与测定方法操作,测定日内与日间(4d内)精密度。6.2拉米夫测定排尿率6.2.1标准溶液的配制精密量取一定量空白尿置50ml具塞试管中,分别精密加入拉米夫定标准溶液(1g·L-1)配成1,5,20,50和100mg·L-1的标准曲线样品,然后按每份1.0ml将所配样品全部分装,贮存于-70℃冰箱备用。质控样品制备方法同上,拉米夫定浓度为3,5及75mg·L-1。6.2.2尿样品的分离取尿样品1.0ml,置5ml试管中,3000g离心10min,取上清在上述HPLC条件下分离测定尿样品,进样量100μl。记录色谱图及拉米夫定的峰高。6.2.3尿样品检测同尿样品的处理与测定。所有受试者的尿样品在同一批内测定,并包括标准曲线和6个均匀分布在待测样品中的质控样品(低、中、高三种浓度各2个)。6.2.4加标回收率的测定分别于1ml空白尿中加入不同量拉米夫定标准溶液配成从低、中、高3种浓度拉米夫定的尿样品(3,5及75mg·L-1),按尿样品的处理与测定方法操作,依法测定回收率。7.药代动力学参数血药浓度数据经WinNonlin(ScientificConsulting,Inc)程序进行曲线拟合并计算药代动力学参数。第1d与第7d药代动力学参数的比较采用配对t检验的方法进行统计学分析。结果1.线性关系和方法的最低检测限1.1按选定的HPLC条件,测得空白血浆及血浆样品的色谱图,见图1a、1b。由图可见血浆中物质在本试验的HPLC条件下对拉米夫定和carbovir的分离测定无任何影响。1.2将标准曲线制备项下测得的不同浓度拉米夫定系列样品的拉米夫定与内标峰高之比为纵坐标,拉米夫定浓度为横坐标,直线回归。结果表明血浆中拉米夫定浓度在0.01～1mg·L-1范围内,浓度与峰高比有良好的线性关系,试验期间共制备标准曲线35条,所有曲线γ2值范围均在0.999～1.000之间。1.3方法的最低检测限与最低检测浓度:本方法的最低检测限与最低检测浓度分别为1ng和0.01mg·L-1。1.4将回收率试验项下的样品测定值代入标准曲线方程,计算出拉米夫定浓度。以测得值与加入值之比计算回收率,4种浓度的平均回收率为98.9%±4.3%(n=24)。1.5表1显示了日内和日间精密度的测得结果。1.6表2显示了本法测定的不同浓度拉米夫定均值的95%可信限。2尿中拉米夫定检测2.1按选定的HPLC条件,测得的空白尿及尿样品的色谱图,见图1c、d。由图可见尿中物质在本试验HPLC条件下对拉米夫定的分离测定无任何影响。2.2将标准曲线制备项下测得的不同浓度拉米夫定系列样品的拉米夫定峰。高作为纵坐标,拉米夫定浓度为横坐标,直线回归。结果表明尿中拉米夫定浓度在1.0～100mg·L-1范围内,浓度与峰高有良好的线性关系,试验期间共制备标准曲线7条,所有曲线γ2值范围均在0.999～1.000之间。本方法的最低浓度为1.0mg·L-1。将回收率试验项下的样品测定值,代入标准曲线方程,计算出拉米夫定浓度。以测得值与加入值之比计算回收率,三种浓度的平均回收率为103.8%±5.0%(n=6)。3.药代动力学程序3.1连续口服单剂量100mg拉米夫定片剂第1d和第7d的经时血药浓度数据均值绘制的药-时曲线见图2。3.2经Win-Nonlin药代动力学程序对血药浓度数据进行处理,按有滞后时间的非房室模型(noncompartmentalmodel)拟合,连续口服100mg拉米夫定片剂第1d和第7d的药代动力学参数见表3。3.3图3显示了中国健康男女受试者口服单剂量100mg拉米夫定片剂第1d尿中拉米夫定的排出,结果显示,在服药后24h内以原形排入尿中的拉米夫定占给药剂量的78.92%±11.03%。4.统计分析用配对t检验法分析受试者连续口服单剂量100mg拉米夫定片剂第1d和第7d的药代动力学参数,结果表明二者无显著性差异。药代动力学参数本研究根据有关文献,建立了稳定的测定拉米夫定的方法。通过方法学的考核,所有分析指标都能满足本实验室标准操作程序(SOP)以及常规药物定量分析的要求。拉米夫定是用于治疗乙型肝炎的药物,如果在临床上长期使用,