我国三个小型猪品系脂联素受体1基因多态性分布

我国三个小型猪品系脂联素受体1基因多态性分布

脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性物质。具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖摄取量、改善胰岛素抵抗、调控血管内皮的炎症反应、抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化等作用,与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病密切相关。脂联素通过与靶细胞膜上的G蛋白耦联受体结合而起作用,受体包括2个亚型,分别为脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2),脂联素受体1在骨骼肌中表达丰富,在调节机体胰岛素敏感性及糖脂代谢中发挥重要作用。为促进我国小型猪在糖尿病和代谢性疾病研究中的应用,我们选取脂联素受体1基因第5外显子至第5内含子之间一段长为366bp的基因片段,探讨其在在中国农大小型猪、广西巴马小型猪和五指山小型猪中的多态性变化。1材料和方法1.1国际农业大学提供了小型猪广西巴马小型猪(6头),由广西大学动物科学技术学院提供;中国农大小型猪(10头),由北京市琉璃河科兴实验动物养殖中心提供;五指山小型猪(6头),由中国农业科学院畜牧兽医研究所提供。1.2方法1.2.1提取dns取上述小型猪的血液各5mL,使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取血液基因组DNA,-20℃保存备用。1.2.2pcr扩增产物的合成参考Izabela等的研究结果,以GenBank登录的序列为模版设计引物(GenBank登录号:AY8275691),上游引物:5’-ttcgggagaaggtggtgtttg-3’;下游引物:5’-tagcactgctcggggagaaaatac-3’送北京三博远志生物技术有限责任公司合成。PCR扩增产物片段位于外显子5~内含子5,长度为366bp。利用上述提取的3个品系小型猪的DNA进行PCR扩增,反应体系(50μL)包括:ddH2O,21μL;上下游引物,2μL;Mastermix,25μL;基因组DNA,2μL。反应条件:94℃预变性4min,94℃变性45s,59℃退火45s,72℃延伸45s,共35个循环,末次循环后72℃延伸10min。反应结束后,取5μLPCR产物于0.8%琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶成像系统观察电泳结果。1.2.3分离产物的测序结果及应用一般自变量pcr产物测序结果通过规划u2005-20将PCR产物委托北京利嘉泰成科技有限公司进行纯化测序(单向测序):利用DNASTAR对PCR产物测序结果进行BLAST分析,并根据以下两个原则确定SNPs:①变异位点处杂合子的测序峰高相对纯合子的而言有明显的降低;②杂合子还会出现另一种测序峰。2结果2.1附加产品的鉴定成功扩增出目的基因片段,长度366bp,电泳结果见图1。2.2ade检测的细胞系统snps分析以中国农大小型猪,广西巴马小型猪和五指山小型猪的DNA为模板,用特异性引物扩增AdipoR-1基因外显子5~内含子5的部分片段(366bp),测序并利用DNASTAR软件BLAST分析测序结果,共筛查到5个SNPs,各多态变化见表1和图2(图2见插Ⅶ)。3重要外显子和内含子检测2003年,Yamauchi等应用分子克隆技术确定人的脂联素受体存在两种异构体,分别称为脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2),其中脂联素受体1位于染色体1p36,包括8个外显子和7个内含子,其中外显子1、外显子2的部分片段、外显子8的部分片段是非编码区,人脂联素受体1基因的结构如图3所示。2004年,Ding等克隆了猪的AdipoR1,将其定位于10p13,共编码了375个氨基酸,与人类AdipoR1基因的同源性是97%。脂联素受体1对球状脂联素的亲和力较高,在肌肉组织中起到介导球状脂联素促进脂肪酸氧化、葡萄糖摄取和增强胰岛素敏感性的作用。Damcott等在安曼人AdipoR1基因中检测出5个单核苷酸多态性(SNPs),发现AdipoR1基因的3个内含子与安曼人2型糖尿病明显相关。Wang等观察了高加索、美洲和非洲的2型糖尿病患者中AdipoR1基因的8个外显子和两侧的内含子,确定了22个SNPs并记录了14个序列变异,但是这些SNPs和2型糖尿病无关联,也不是高危家族非糖尿病成员胰岛素敏感性和胰岛素分泌的决定因素。可见,脂联素受体1基因与2型糖尿病的相关性存在着种族的差异。Izabela等研究了猪AdipoR1的外显子5至内含子5之间的一段长为366bp的片段,结果显示,该片段中不存在有意义的多态性变化。本文参考Izabela的研究,在三个品系小型猪的基因组DNA中成功扩增出目的片段,但是所得到的结果与Izabela等的研究结果完全不同。本实验共检测出了5个SNPs。SNP1:G138A,所有的样本都出现该变化,并导致第45位氨基酸由甘氨酸(Gly)变为谷氨酸(Glu)。SNP2:G185A,所有的纯合突变均发生在五指山小型猪品系中(4/6,66.67%),而所有的杂合突变则发生在中国农大小型猪品系中(3/10,30%)。SNP3:G200A,全部发生在中国农大小型猪品系中,且均为杂合突变(3/10,30%)。SNP4:C295T,发生在广西巴马小型猪品系中的突变既有杂合突变(1/6,16.67%)也有纯合突变(2/6,33.33%),发生在中国农大小型猪品系中的突变全为杂合突变(2/10,20%),可能是因为小型猪品系之间存在着差异,也可能是个体之间的存在着遗传差异的原因。SNP5:T337G,只出现在中国农大小型猪品系中,且为杂合突变(1/10,10%),只有一个样本发生该点变化。在本实验中,SNP2~SNP5都位于内含子5中,可能是不同动物品系的遗传差异所致,而SNP1的突变率达到100%,而且引起了氨基酸的改变,表明这一位点可能是我国小型