二氢杨梅素的稳定性研究

二氢杨梅素的稳定性研究

腾茶又名红葡萄属植物，是一种又名“汉d-maoya”的野生藤本植物。它是属于葡萄科的一种野生藤本植物。它是所有植物的一种。它尝起来又甜又淡，很新鲜。具有清热解毒、散风除湿、强筋骨骼等功效。自古以来,壮族和瑶族人民将其幼嫩茎叶经过杀青、揉捻、烘干保健茶,具有营养丰富、回味甘甜、清热解毒、生津止渴、润喉散痰等特点,用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疮疖等症,夏天泡茶数日不馊,有“神茶”之称。化学研究表明,藤茶是一种富含黄酮类化合物的罕见植物,有效部位黄酮总量达30%左右,其中主要成分为二氢杨梅素(Dihydromyricetin,简称DMY)。药理研究表明,DMY能对抗去肾上腺素和高K+所致的兔胸主动脉条的收缩反应及显著扩血管和钙阻滞作用,具有消炎、抑菌、止咳、镇痛、消脂及抗脂质过氧化等功效。因此,DMY具有广泛的应用前景。由于DMY的结构中具有六个羟基,结构不稳定,其自身往往易氧化成低活性甚至没有活性的氧化产物,特别是在天然植物原料加工过程中,发生自动氧化对其活性损失很大,因此了解影响其自动氧化的因素,对保证DMY活性具有重要的理论意义和实际指导意义。仪器与试药BF-KNAUER高效液相色谱仪(K501高压输液泵,K2501紫外分光检测器,BF2002色谱工作站,北京北分瑞利分析仪器(集团)有限责任公司);Scout百分之一电子天平(梅特勒-托利多常州衡器有限公司);FA2104万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂);METTLERTOLEDO320SpH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。二氢杨梅素(DMY)对照品为从湖南江华产藤茶中分离得到,经UV,IR,MS,1H-NMR光谱分析鉴定结构,归一化方法检测,含量在99.0%以上;所用化学试剂均为国产分析纯。方法与结果1流动相、脱气曲线色谱柱:江苏汉邦公司LichrospherC18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水-磷酸(25∶75∶0.1),应用前经过0.45μm微孔滤膜抽滤,超声脱气;流速:1.0mL·min-1;进样量:20μL;柱温:25℃;检测波长:290nm。2酶活剂精密称取0.05g的DMY对照品置50mL量瓶中,加入50%的乙醇定容至刻度,配成1mg·mL-1的照品贮备溶液。精密吸取该对照品贮备溶液0.1,0.2,0.4,0.8,1.2,1.6mL置25mL量瓶中,加甲醇至刻度摇匀,配制成4.0,8.0,16.0,32.0,48.0,64.0μg·mL-1系列浓度溶液。在上述色谱条件下,进样20μL,以DMY的峰面积(A)对DMY的浓度(C,μg·mL-1)进行线回归处理,得方程:A=6.59×104C+3.64×103,r=0.9993,线性范围为4.0~64.0μg·mL-1。3复进样峰面积rsd精密吸取同一浓度的DMY对照品溶液20μL,重复进样5次,峰面积的RSD为1.2%。精密吸取同一批样品溶液20μL,每隔1h测1次,连续测5次,RSD为1.6%。表明本试验重复性及稳定性均良好。4影响dmy溶液稳定性的研究4.1dmy在不同ph值的缓冲溶液中的降解用Tris-HCl及Tris-NaOH配制成pH值为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0的缓冲溶液。精密量取11份5mL的1mg·mL-1DMY溶液分别置于50mL量瓶中,除其中1份用蒸馏水定容至刻度外,剩余10份分别加入不同pH值的缓冲溶液至刻度,摇匀配制成DMY含量为0.1mg·mL-1的系列溶液,在37℃水浴中自然散射光下密封放置,测定DMY在不同pH下的紫外吸收光谱,结果见图1。同时pH3.0~8.0的缓冲溶液配置的样品于0,3,5,7,14,21,28d定期取样1mL,真空冻干,以HPLC流动相定容1mL,HPLC法测定在不同pH值下DMY的保存量。以浓度的对数对时间作图,结果见图2。从图1看出,在pH≤8条件下的DMY水溶液的最大吸收峰均在290nm,在pH9.0~12.0下290nm特征峰消失,而在325nm处出现最大吸收峰。此结果说明,pH≥9.0时DMY因处于碱性环境而发生自动氧化作用,生成了其他成分。图2表明,DMY在不同pH值条件下降解属一级动力学反应。按动力学一级反应的数学模型,计算不同pH值下的DMY降解的动力学方程及降解速度常数及半衰期见表1。由该表可见,pH≤5时DMY较稳定。4.2动力学反应模型取DMY含量为0.1mg·mL-1的pH值为4.0的缓冲溶液各6份,分别在4℃,37℃,45℃,65℃,85℃保温处理并定期取样1mL,真空冻干,以HPLC流动相定容1mL,HPLC法测定DMY的保存量,以浓度的对数对时间作图,结果见图3。从图3可见,pH值为4.0的DMY缓冲溶液在不同温度下降解属一级动力学反应。按动力学一级反应的数学模型,计算pH值为4.0的DMY缓冲溶液在不同温度下降解的动力学方程及降解速度常数及半衰期见表2。由该表可见,pH值为4.0的DMY缓冲溶液在室温环境下比较稳定。4.3金属离子稳定性测定称取FeCl3,CuSO4,AlCl3,用pH4.0的Tris-HCl缓冲溶液分别配置成含Fe3+,Al3+,Cu2+金属离子0.25mmol·L-1的溶液。量取2.5mL的1mg·mL-1的DMY溶液5份,分别置于25mL量瓶中,其中3份分别加入上述含不同金属离子的溶液1mL,而后5份溶液均用pH4.0的Tris-HCl缓冲溶液定容至刻度。取其中1份未加任何金属离子的溶液室温避光放置,剩余4份溶液于室温自然散射光下放置,定期取样1mL,真空冻干,以HPLC流动相定容1mL,HPLC法测定DMY的保存量,结果见表3。从表3可见,经过室温在散射光下放置28d后,DMY的含量由起始的100μg·mL-1下降至77.8μg·mL-1,同等条件但避光放置则DMY下降较少,89.7μg·mL-1,说明光照射对DMY的稳定性有一定的影响;不同金属离子对DMY稳定性有不同的影响,其中Fe3+和Al3+的影响较为显著,一周后分别使DMY的含量由起始的100μg·mL-1下降至58.9和67.4μg·mL-1,而Cu2+使DMY的含量下降至89.5μg·mL-1,影响相对较小。ph值对dmy活性的影响DMY为一弱酸性物质,在影响因素考察实验中发现,pH值、温度、不同金属离子、光线对DMY稳定性有明显影响。实验结果表明DMY在pH≤4的弱酸性条件下能稳定存在,随着pH值的增加,会加速氧化,特别是pH≥9的碱性条件下会立即反应氧化。温度的升高,Fe3+,Al3+,Cu2+等金属离子的存在以及光线均可以加速DMY的氧化。本实验的结果提示,为使DMY能较长时间稳