人体寄生虫学实验指导

PAGE1PAGE70人体寄生虫学实验指导中山大学中山医学院寄生虫学教研室2002年9月目录实验室规则…………1光学显微镜的使用注意事项………2华支睾吸虫…………4布氏姜片虫…………7并殖吸虫……………...8日本血吸虫…………11带绦虫………………20曼氏迭宫绦虫………21细粒棘球绦虫………22似蚓蛔线虫（蛔虫）………………..25毛首鞭形线虫（鞭虫）……………..27钩虫…………………28蠕形住肠线虫（蛲虫）……………..30丝虫…………………33旋毛形线虫（旋毛虫）……………..35肠道寄生虫病原学检查……………38溶组织内阿米巴和其它阿米巴……41蓝氏贾第鞭毛虫……………………45阴道毛滴虫…………46杜氏利什曼原虫……………………47疟原虫………………50机会性致病原虫…………………….56蚊……………………61蝇……………………66白蛉、蚤、虱和其它节肢动物……67实验室规则进实验室上课时必须穿白大衣，并携带教材、实验指导、实验报告本及必要的文具(如钢笔、铅笔、彩色铅笔、小尺等）。实验前做好预习，明确实验目的和要求，了解每个实验的基本原理和具体做法,通过实验，加深和巩固已学过的理论知识，从而达到理论和实践相结合的目的。严格遵守操作程序，爱护教学标本、仪器、试剂、动物，如有遗失或损坏应报告老师，并按学校规定进行适当赔偿。实验操作时要耐心细致，自己动手，独立思考，严格要求，培养实事求是的科学态度和认真负责的作风。上课要准时，不得无故缺席、迟到或早退，特殊情况外出或早退应向老师请假。遵守课堂纪律，保持实验室的安静，关闭手机、呼机，不得高声谈笑，随便走动或进行与实验无关的活动。动物尸体、玻片、器皿、垃圾应按要求放到指定地点，严禁丢入水池内，以免堵塞排水管。8.值日生应负责搞好实验室的清洁卫生，离开实验室前应关好水、电、门窗。

光学显微镜的使用注意事项1.显微镜的使用使用自然光源的显微镜时应面向光源，拨正低倍接物镜，调节反光镜至最大亮度，将标本置载物台上，根据检查标本的需要，把光线调至适宜强度，用粗调调至能看清物像后，再用细调调至最清晰。如果要转换高倍观察，可将待观察部位移至视野中央，拨转高倍接物镜即可。若高倍与低倍焦点不一致，则须先摸索好高倍和低倍的位置和焦距的关系，并牢记二者的关系，以后便可以自由转换高、低倍镜。用油镜时，先进行高倍观察，将待观察部位移至视野中央，然后用粗调提高接物镜，在载玻片上加一滴镜油，拨转油镜，眼睛从旁注视，用粗调向下旋转使物镜与玻片之间成最小距离，然后用细调上下旋转至清晰，或直接用油镜观察。如果你使用的是带电光光源的显微镜，请注意，取出显微镜后，先将电源插头插入电源插座，检查亮度调节柄确实在最低处时，方可开启电源开关，推动亮度调节柄至合适的亮度。观察完毕，检查显微镜按规定清洁后，下降镜台，推动亮度调节柄至最低位置，然后关电源，拔电源插头，将显微镜放回原处。2.放大倍数的计算用目镜的放大倍数乘以物镜的放大倍数，等于该显微镜的放大倍数。例如观察肺吸虫虫卵，目镜上为10×，低倍物镜上为10×，那么肺吸虫卵在低倍镜下的放大倍数为10×10＝100倍。高倍镜上刻有45×，肺吸虫卵在高倍镜下的放大倍数为10×45＝450倍。观察原虫标本需用油镜，油镜上刻有100倍，油镜下的放大倍数为10×100＝1000倍。3.观察标本的方法镜检时载物台不可倾斜，以免液体流出影响观察及污染显微镜。观察标本时，每一个视野都要详细观察。为了减少遗漏，可按一定方向推进如↓→↑→↓→。如有可疑物像，可放大倍数观察。不论放大倍数如何，光线的强度都要适宜。一般来说，高倍、油镜和比较厚的标本要求较强的光；低倍、无色标本光线宜弱。调节光线的强弱可通过上下调节聚光器或光圈的扩大和缩小或调节光源的强弱来控制。4.显微镜的维护显微镜是比较贵重的仪器，也是学习的重要工具之一，维护好它十分重要。提取显微镜时，一手持柄，一手托住底座，保持镜身的垂直，防止反光镜和目镜脱落。显微镜的部件不得互相调换，如有损坏，立即向老师报告。检查粪便标本时，如要用高倍观察，必须加上盖玻片，防止粪水污染镜头，如不小心污染，应立即擦干净。用高倍镜或油镜观察时，宜使用微调，并小心转动，避免压碎损坏镜头和标本。每次使用显微镜后都要擦拭干净，镜台镜座用软布擦去污物和灰尘。擦镜头必须用擦镜纸，不能用草纸或纱布等。油镜使用后，应立刻用擦镜纸擦干净镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许二甲苯拭抹镜头，最后用擦镜纸擦干残余的二甲苯。若油已干，可沾少许二甲苯擦净，再用擦镜纸擦干。如镜头沾上较顽固的污物也用同样的方法拭抹。收镜时将镜头旋在一侧，将聚光镜旋落，避免两镜头相撞。把亮度调节柄推至最低位置，把光源调至最小，关上电源。最后加上镜罩（或置镜箱内）放回原处。

吸虫(trematode)一、华支睾吸虫（Clonorchissinensis）目的和要求以华支睾吸虫为代表，掌握吸虫基本形态和生活史的基本特点。了解感染途径、感染方式、寄生部位与致病作用及防治要点。掌握虫卵形态特征和病原学诊断方法。学习绘制虫卵形态图的基本技能。实验内容成虫观察液浸标本（示教）：注意虫体大小、外观。观察染色标本（操作）：先用肉眼作一般观察，然后在低倍镜下观察下列器官的位置、排列方式和形态特征：附着器官：口吸盘、腹吸盘，并比较两者的大小。消化器官：肠支分两支，末端是盲端。排泄器官：排泄囊和排泄孔。生殖器官：雌雄同体。雄性生殖器官：睾丸的数目、形态、位置、排列方式等。雌性生殖器官：卵巢、受精囊、卵黄腺、梅氏腺、子宫（其内充满虫卵）等。（二）中间宿主和幼虫（示教）第一中间宿主：纹沼螺、长角涵螺。观察尾蚴染色标本。第二中间宿主：淡水鱼（鲤科鱼）、淡水虾。囊蚴形态特点：椭圆形，平均大小为0.138mm×0.115mm，囊壁两层，内含幼虫，可见口、腹吸盘及含有黑色颗粒的排泄囊。虫卵(1)虫卵形态（固定标本）（操作）从大小、形态、颜色、卵壳结构和内含物等五个方面详细观察。虫卵很小，平均为27~35μm×12～20μm，形似旧式灯泡或芝麻状，黄褐色，顶端有突起的卵盖，卵盖和卵壳镶嵌处稍向外突起形成肩峰，另一端有一小疣，卵内有一毛蚴。虫卵扫描电镜照片（示教）。病理标本1.成虫在肝胆道内的大体标本（示教）。2.成虫在肝胆道内的病理组织切片（示教）。胆道内可见华支睾吸虫成虫横切面，大量虫卵散布在子宫腔内，胆管上皮细胞增生，呈乳头状突向管腔，胆管周围纤维组织增生，压迫肝实质。作业绘作业：绘虫卵形态图。用铅笔描绘，以点和线构成轮廓图，线条要平滑，不涂阴影，不涂彩色，注意用铅笔描形态和大小的比例，绘出特征，力求真实准确。2.标注成虫形态图（用平行线标注各部位的名称）。3.用简图（如箭头）描述华支睾吸虫的生活史过程。（概述该虫的终宿主、保虫宿主、成虫寄生部位及其主要损害器官，虫卵排出途径和病原学诊断方法，第一、第二中间宿主及其幼虫在宿主体内的发育过程，感染期、感染方式和途径等。）思考：食入未煮熟的淡水鱼可能会感染什么寄生虫病？参考资料受精过程和虫卵形成：精子产生后，经雄性生殖孔进入雌性生殖孔内，到达受精囊。受精通常在输卵管内进行。受精卵进入卵模，来自卵黄腺的卵黄细胞亦随之而入，同时也有来自梅氏腺和卵黄球分泌的卵壳前体物进入卵模。当输卵管末端收缩时卵模成关闭状态，随后卵模收缩形成卵壳的特殊形状。卵壳形成时先从中间部分开始、末端部分跟着出现，最后配上卵盖。吸虫亦可进行异体受精：即一方的精子经生殖孔或劳氏管（退化的阴道）进入另一方体内。2.华支睾吸虫第二中间宿主淡水鱼调查在鱼塘、水沟内捕捉或市场等处购买各种淡水鱼，经种属鉴定后，取鱼肌肉等不同组织，切成小块置玻片下压片检查囊蚴。3.华支睾吸虫囊蚴分离法将华支睾吸虫第二中间宿主——淡水鱼置搅肉机内搅碎（亦可用手工剁碎）。每10克鱼肉用250毫升消化液（配方：胃蛋白酶9.8克，1N盐酸164毫升，氯化钠17克，加水至2000毫升）消化4～12小时，用铜筛过滤去掉粗渣，滤液经反复多次生理盐水换水沉淀，最后吸取沉淀物置培养皿内在双目镜下检查囊蚴。4.动物感染方法将分离出的形态不同的各种囊蚴按号分别置于培养皿内，取实验动物豚鼠或家兔，用吸管吸取50或200个囊蚴分别经食道喂给豚鼠或家兔，标记实验动物，同等条件下饲养，40天后麻醉致死，剖开腹腔，取出肝胆器官，沿胆总管至胆囊剪开，寻找成虫，然后检查肝内的小胆管，把组织剪成数块，向剪开处轻轻挤压，把成虫挤出。见有成虫即取出置盛有生理盐水的器皿中进行观察鉴定，必要时可染色鉴别。二、布氏姜片虫（Fasciolopsisbuski）目的和要求了解成虫的基本形态和生活史的基本特点。从成虫的体积和腹吸盘的大小理解其机械致病作用。掌握虫卵特征和病原学诊断方法。熟识植物媒介，掌握防治要点。实验内容成虫成虫液浸标本（示教）成虫染色标本（操作）注意虫体大小，背腹扁平肥厚，腹吸盘较口吸盘大4～5倍，肌肉相当发达。（二）中间宿主、幼虫和媒介（示教）中间宿主：扁卷螺尾蚴染色标本囊蚴染色标本媒介：菱角、荸荠（马蹄）等。（三）虫卵虫卵形态（操作）虫卵大小约130~140μm×80~85μm，椭圆形，淡黄色，卵壳薄，卵盖小（不明显），卵内含一个卵细胞和数十个卵黄细胞。虫卵扫描电镜照片（示教）（四）作业：1.绘虫卵形态图。2.标注成虫形态图三、并殖吸虫(Paragonimus)目的和要求了解卫氏并殖吸虫的形态特征和生活史。了解并殖吸虫寄生部位和主要致病作用。掌握卫氏并殖吸虫虫卵的形态特征和病原学诊断方法。实验内容卫氏并殖吸虫（Paragonimuswestermani）1.成虫(1)成虫液浸标本（示教）(2)成虫染色标本（操作）①外部形态②口、腹吸盘③生殖器官：两个睾丸位于虫体后1/3，左右并列，卵巢与子宫并列于腹吸盘之后。(3)成虫皮棘扫描电镜照片（示教）2.幼虫和中间宿主(1)第一中间宿主：川卷螺（示教）(2)尾蚴染色标本：尾部短小，呈圆球状。（示教）(3)第二中间宿主：溪蟹、虫刺蛄（示教）3.虫卵(1)虫卵形态：（操作）虫卵呈金黄色，长椭圆形，形态常不规则，大小为80~118μm×48~60μm。卵壳厚薄不均，卵盖大，常倾斜，卵内含有一个未分裂的受精卵细胞和十多个卵黄细胞。(2)虫卵扫描电镜照片（示教）4.病理标本(1)肺吸虫病肺脏病理标本：注意结节状或半球状突出的虫囊（示教）。(2)肺吸虫病肝脏病理标本：注意肝脏表面的窟穴状或隧道状病变（示教）。思考：肝、肺两器官损害的结果和损害机理有何不同？斯氏狸殖吸虫(Pagumogonimusskrjabini)1.成虫液浸标本（示教）2.成虫染色标本（示教）3.第一中间宿主：拟钉螺（示教）作业(1)标注卫氏并殖吸虫成虫形态图。(2)绘卫氏并殖吸虫虫卵图。(3)用简图(如箭头)描述卫氏并殖吸虫的生活史过程。思考：怎样理解一些山区森林地带肺吸虫病是自然疫源性疾病？肺吸虫病的流行区有何特点？参考资料1.痰液虫卵检查法涂片法：取一洁净玻片，滴一滴生理盐水，挑取带铁锈色的痰液少许，在玻片上涂均匀，加盖玻片，置镜下检查。虫卵浓集法：收集病人24小时的痰液，将痰液倾入量杯内，加入等量的10％NaOH溶液，摇匀，静置6～8小时，自然沉淀或离心沉淀后，倾去上清液，取沉渣镜检。2.肺吸虫流行病学的生物宿主调查选择一条或数条沟渠，在沟渠内捕捉川卷螺（或拟钉螺）和溪蟹或虫刺蛄。（1）将川卷螺击破后把螺内脏置玻片上，撕碎加适量0.45%盐水，置镜下寻找胞蚴、雷蚴和尾蚴。（2）解剖溪蟹或虫刺蛄，找囊蚴。3.囊蚴分离取溪蟹一只，去壳后用研钵磨碎，加入适量的0.45%盐水，用钢筛滤去粗渣，滤液自然沉淀，倾去上清液（换水2～3次，至上清液澄清为止），吸取沉渣于培养皿内置双目镜下检查囊蚴。囊蚴呈白色圆球形，囊壁两层，内含一条卷缩的幼虫，两侧可见波浪状的肠管，排泄囊含黑色颗粒。4.动物感染实验从溪蟹分离出并殖吸虫囊蚴，用肉类将囊蚴包裹后，喂犬。视实验犬的大小而定，每只喂100～200个囊蚴。饲养2～3个月后将实验犬麻醉致死，剖开胸腔暴露肺脏,可见肺表面有结节状或球状虫囊，剪开虫囊找出虫体。5.脱囊试验把活囊蚴置于盛有猫胆汁的培养皿内，在37oC温箱内孵育1~2小时，取出镜下观察后尾蚴。四、日本血吸虫(Schistosomajaponicum）目的和要求了解毛蚴、尾蚴及成虫的形态和生活史特点。通过动物实验了解血吸虫的感染期、感染途径和致病作用。掌握虫卵形态特征和病原学诊断方法。了解免疫学诊断方法和意义。实验内容成虫成虫活体标本（示教）成虫雌雄合抱标本（示教）成虫染色标本（操作）注意以下几点：雌雄成虫的大小、形态。口、腹吸盘，腹吸盘突出。生殖器官：雌雄异体。雄性生殖器官：睾丸数目、形态、位置和排列方式。雌性生殖器官：卵巢、子宫（注意子宫内有虫卵）、卵黄腺。成虫前端扫描电镜照片（示教）幼虫和中间宿主1.毛蚴毛蚴扫描电镜照片（示教）2.中间宿主：钉螺（示教）3.尾蚴尾蚴染色标本：注意尾部分叉（示教）。观察活尾蚴（示教）。静止时尾蚴体部悬挂在水面，活动时体部伸缩，尾干作反复弧形摆动，尾叉作旋浆式转动，使身体向前推进。虫卵1.日本血吸虫虫卵形态：（操作）虫卵呈宽椭圆形，大小89μm×67μm，淡黄色，卵壳薄而均匀，无卵盖，有一小侧棘。通常从粪便中排出的虫卵，其卵壳周围常有污物粘附。成熟虫卵内含有毛蚴。2.日本血吸虫虫卵扫描电镜照片（示教）。3.曼氏血吸虫(S.mansoni)虫卵：长椭圆形，有粗大侧棘。（示教）4.埃及血吸虫(S.haematobium)虫卵：长椭圆形，有端棘。（示教）致病作用1.病理标本血吸虫病肝硬化病理标本：肝表面有许多灰白色芝麻大小散在性分布的结节，切面在静脉周围有灰白色树状纤维索。（示教）(2)血吸虫病肝组织切片。急性虫卵结节：虫卵周围有大量的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润及以虫卵为中心向四周发出的放射状嗜酸性细棒状物质沉积。（示教）慢性虫卵结节：虫卵已死亡或钙化，虫卵周围可见到上皮样细胞，异物巨细胞聚集和纤维细胞增生等。（示教）(3)血吸虫成虫寄生在肠系膜的病理标本2.解剖实验动物（家兔）（小班操作）将感染血吸虫尾蚴50天左右的家兔处死，剖开腹腔后注意观察记录下列内容：①有无腹水？②肝脏有何变化？肠壁有何变化？在何处找到血吸虫成虫？是否有异位损害现象？肠组织压片法检查：取米粒大小的直肠粘膜组织，置玻片上，取另一玻片压片检查，可见虫卵如何排列，并见到什么时期的虫卵？实验诊断方法1.病原学检查粪便直接涂片法、毛蚴孵化法、透明法、直肠活组织检查等，见教材P1432.免疫诊断法环卵沉淀试验：(示教)实验方法参照教材P143判断标准：－：虫卵周围沉淀物的直径小于10μm。＋：虫卵周围的泡状沉淀物直径大于10μm，累计面积小于虫卵面积的1/2，或指状细长卷沉淀物不超过虫卵的长径。＋＋：虫卵周围的沉淀物面积大于虫卵面积的1/2，指状沉淀物相当于或超过虫卵的长径。＋＋＋：沉淀物的面积大于虫卵的面积，指状沉淀物相当于或超过虫卵长径的二倍。(2)快速ELISA法（小组操作）实验原理：酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunologysorbentAssay,ELISA)已广泛用于多种寄生虫感染的检测，FAST-ELISA是在ELISA的基础上发展起来的一种快速检测方法，它是用已知日本血吸虫可溶性抗原包被在特制的聚苯乙烯反应板孔内，将待测血清加到反应孔内，如血清中含有相应的特异性抗体，即可形成抗原抗体复合物。此时，如在反应孔内加入酶标记羊抗人IgG，再通过底物的显色反应即可判断实验结果。特点：灵敏、快速、准确、简便。试剂盒内试剂名称：①号液：酶结合物②号液：洗涤液③号液：底物溶液④号液：显色剂⑤号液：血清稀释液⑥号液：终止液检测程序：样本稀释：8滴蒸馏水中加1滴待测血清及1滴血清稀释液，混匀。对照阴、阳性血清作同样稀释。（此步已做）加样：分别加稀释的待测血清和参考阴阳性血清各1滴于反应板孔中，室温放置3～5分钟。抛尽后加1滴②号液，立即用自来水冲洗3次，抛尽，在吸水纸上拍干。反应:加①号液1滴，置室温3～5分钟，抛尽，加②号液1滴，立即用自来水洗5次，抛尽，在吸水纸上拍干。显色：加③号液和④号液各1滴于孔中，室温静置30秒～3分钟（待阳性对照显色而阴性对照未显色为准）后，加⑥号液1滴观察结果。(5)结果判断：在白色背景下观察蓝色的深浅－：浅于阴性或与阴性对照一致；＋：深于阴性对照，浅于阳性对照；＋＋：与阳性对照相近；＋＋＋～＋＋＋＋：明显深于阳性对照。注意事项：①试剂置2～8℃保存，用前轻轻摇匀；②严格按检测程序操作，所有试剂应加入孔中，避免粘在壁上，加样后轻轻摇匀；③自来水冲时，水流不能过猛，每次抛干后，在吸水纸上轻轻拍干；④室温低于15℃时，显色时间应适当延长，以阳性对照出现明显蓝色而阴性对照孔基本无色为准。流行病学（示教）晚期血吸虫病人照片。血吸虫病流行区照片。灭螺方法照片。作业标注成虫基本形态图。绘虫卵形态图。写出解剖动物（兔）实验报告。写出快速ELISA法检测日本血吸虫感染实验报告。思考：根据动物感染结果，理解日本血吸虫对宿主可造成什么损害？(2)从生活史过程比较日本血吸虫与其它吸虫的感染方式和感染途径有何不同？(3)日本血吸虫的防治措施与其它吸虫比较有何不同？为什么？参考资料

1.组织内各期血吸虫卵的性状：由于虫卵发育的程度和虫卵死亡时间的不同，沉积在肠粘膜和其他组织内的虫卵可有不同性状。通常可分为活卵，近期变性卵和死卵。

活卵：淡黄色，毛蚴轮廓清楚，壳薄、胚胎清楚。近期变性卵：黄色带灰白或黄褐色，毛蚴萎缩成块状，壳稍厚但均匀，胚膜尚清楚。死卵：灰白色至黑色，内容物模糊或成块状裂开、壳厚而不平整，甚或破裂。2.虫卵分离方法：以1500～2000条日本血吸虫尾蚴感染家兔。感染后42天将家兔处死，取出肝脏，冲洗。除去成虫，把肝脏剪成小块，除去结缔组织，血管等。放入组织捣碎机内，加l～2％盐水，用12，000转／分的速度捣碎，每次3分钟，间歇5分钟，通常捣碎3～4次即可。将捣碎的肝组织悬液加1000毫升1％盐水调匀，用80、120目的铜筛过滤，去渣将滤液分别盛装在尖底离心管内，1500转／分离心3分钟。此时管内分三层，上层是清液，中层为肝组织碎片，下层为金黄色的虫卵和肝组织的混合物。吸去中、上层。将各管底层沉淀物加盐水制成悬液，然后合并，如此反复离心沉淀，除去中上层，最后获得较纯净的虫卵。3.荧光显微技术在寄生虫学方面的应用几乎所有寄生虫(包括原虫、蠕虫等)都可用荧光显微技术进行研究。例如：抗原抗体反应在组织和细胞的定位研究，追踪寄生虫在人体的转移过程，形态变化和寄生虫病发病机理等。还可利用荧光抗体的免疫学特性研究抗体对寄生虫虫体作用部位及宿主抵抗寄生虫侵袭的免疫反应机制等。免疫荧光法可检出特异性抗体或抗原。此法敏感性高，特异性同其他血清学方法类似。现在较常用于血吸虫病，丝虫病和疟疾的研究和诊断。4.死卵与活卵的染色鉴别法：吖啶橙染色法原理：用吖啶橙处理后的生物标本，在荧光显微镜下含DNA的成份发出绿色荧光，含RNA的成份发出红色荧光。因此，血吸虫卵经吖啶橙处理后，初产期虫卵和空泡期虫卵因含丰富的RNA，故卵内呈现粗细不等的红色荧光亮点。以后虫胚逐渐发育DNA迅速增加，分布在虫胚四周,形成黄绿色荧光的胚团。虫卵内毛蚴发育成熟后，含丰富RNA的头腺发出明亮的橙红色荧光，而生殖细胞和神经中枢发绿色荧光,整个虫卵呈红绿相嵌的荧光色彩。虫卵死亡后，核酸逐渐分解，橙红色或绿色的特异荧光也相继消失。方法：将带有血吸虫卵的肠粘膜(或其它组织)碎片置康氏管内，加入0.5～1.0毫升1：10，000吖啶橙溶液，摇荡，置37℃温箱内染色2小时，用PH7.4PBS洗涤两次。将组织碎片置载玻片上，覆以盖玻片，在荧光显微镜下检查。结果：活卵呈橙红色或红绿相嵌的荧光。死卵无橙红色荧光亮点，或因吖啶橙不着色而使虫卵呈黄色自发荧光。5.毛蚴孵化法原理：成熟虫卵在适宜条件下，24h~48h可孵出毛蚴，且毛蚴具有向光性，向上性，多在水面表层作直线运动。方法：取新鲜受检粪便约30g，先经浓集法沉淀处理，将得到的沉渣倒入500ml的三角烧瓶中，加清水（自来水要去氯）至瓶口，在20~30℃条件下孵化12h~48h，用肉眼或放大镜观察结果。毛蚴：双目镜下观察，体表披棘毛，前端突出。主要根据以下特征辨认：⑴针尖大小，长圆形，大小一致。⑵半透明，灰白色，有折光。⑶作直线的斜向或横向运动。⑷一般在水面下1~4cm处。6.间接免疫荧光实验(IFA)间接免疫荧光实验是敏感性高、特异性强、操作简便、所需反应物(抗原、抗体)量少的一种免疫学实验。lFA系将已知抗原(组织切片)固定在玻片上,将待测抗体滴加到玻片上，如血清含有相应抗体,即可在特定部位与抗原起反应形成抗原抗体复合物,此种复合物再与荧光色素标记的抗体反应,形成带荧光的抗原抗体第二抗体的第二复合物,在荧光光源激发下,特异复合物呈现特异荧光。如待测血清无特异抗体,则不形成特异复合物而不显荧光；如抗体特异性不同,则形成特异复合物的位置不同,特异荧光可在组织切片不同部位显示出来。此法可用于诊断或抗原定位。材料:抗原：感染日本血吸虫尾蚴约50天的家兔，解剖后取出肝脏及门脉系统中的血吸虫虫体，洗净后置Rossman’液中过夜，取出,在75％乙醇中洗去残存Rossman’s液并在75％乙醇中贮存。按常规制成5微米切片，脱蜡后备用。②第一抗体：感染日本血吸虫的家兔血清。

③第二抗体：异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔IgG。

④对比染色液：溶解10mg伊文思蓝于10ml磷酸盐缓冲液中，置冰箱待用。

⑤缓冲液：0．05MpH7.8磷酸盐缓冲液(PBS)。⑥正常家兔血清：用作对照。反应步骤:用油性笔在玻片上组织切片周围划一小圈，加10μl第一抗体于切片上，置湿盒中在37℃温箱下反应30分钟。另一组织切片滴加正常家兔血清做对照。用0.05MpH7.8PBS轻轻彻底洗去第一抗体(注意切勿用力冲洗以免切片脱落)，玻片自然干燥。预先用伊文思蓝液及PBS稀释第二抗体至工作浓度，使第二抗体工作液的伊文思蓝最终浓度为2／10，000。加10μl于切片上，置湿盒中37℃反应30分钟。④用PBS彻底洗去第二抗体，玻片自然干燥。⑤用0.lMpH7.8PBSlml加甘油9ml制成缓冲甘油液。加一滴于切片上，加盖玻片。(注意勿使切片上残留小气泡，否则会影响观察)。⑥置荧光显微镜下观察结果。(用通过BG12十BG38滤光片产生的紫蓝光作激发光)。结果：在紫蓝光的激发下，经荧光素标记第二抗体所形成的特异复合物的部位显现明亮的黄绿色荧光，不形成特异复合物的部位因伊文思蓝着色的关系，呈现暗红色荧光。依特异荧光的强弱及出现部位的不同，可对抗原的特异性和定位做出估计。与阳性血清起反应的抗原按感染进程出现的先后顺序依次为肠相关抗原(GAA)、膜相关抗原(MAA)、虫卵可溶性抗原(SEA)及体抗原(SA)。GAA:属诊断性抗原，定位于血吸虫成虫的肠上皮组织，有时在肠内容物中亦可见到。呈现明亮的黄绿色荧光。在感染过程中最早出现(尾蚴感染后约4～5周)，最迟消退。MAA：主要为保护性抗原，定位于成虫表膜，在感染尾蚴后约5～6周出现，荧光较弱，反应不够稳定。MAA在诱发血吸虫保护性免疫中具有重要作用。SEA：属诊断性抗原，定位于成熟虫卵的毛蚴、卵黄膜、卵内分泌物及虫卵结节环绕虫卵的部位，有时亦可见于宿主肝窦的星状细胞中，于尾蚴感染后的第6周出现，在卵内毛蚴(特别是头腺)及毛蚴周围出现明亮荧光。在急性虫卵结节内虫卵的周围呈现雾状光点，反应稳定。SA：定位于成虫的间质组织，在尾蚴感染后约第7周出现，呈大小不等亮度中等的点状荧光，显示虫体组织代谢物，是虫体抗原的重要来源。7.血吸虫病诊断方法(1)以镜检为基础的血吸虫虫卵检测。(2)免疫学诊断概况：①纯化抗原、重组抗原、合成抗原等新一代诊断抗原的应用使循环抗体（CAb）检测的诊断效能大为改观；②单克隆抗体（McAb）在检测循环抗原（CAg）中的应用已较为普遍；③循环免疫复合物（CIC）检测已取得一定进展，可望成为血吸虫病尤其是晚期血吸虫病患者有效和可取的诊断方法。日本血吸虫感染，早期（10wk内）CAg检测显示优势；中期（10-20wk）循环抗体（CAb）检测显示优势；晚期（14-28wk）CIC检测显示优势。由于查病对象主要是急、慢性病人和晚期病人，用CAg和CAb联合检测，可起诊断互补作用。检测CAg较检测CAb更具优点，CAg是现症感染的依据，能反映感染虫荷，可用于考核疗效并可检测疫苗效果。从尿中检测血吸虫CAg可避免采血所致的肝炎、爱滋病传播的潜在危险。它的无创伤性、简单、方便的特点易于被病人接受，更适合现场应用。CAg主要有三大类：(1)膜相关抗原（MAA），(2)肠相关抗原（GAA），包括CAA和CCA；(3)可溶性虫卵抗原（SEA）。血吸虫CAg的检测：检测CAg所用的抗体特性：MCAb能识别血吸虫特有抗原，识别位点为血吸虫重复性表位，具有较高的亲和力。目前常用的血吸虫CAg的检测方法：反向间接血凝、直接斑点ELISA、双抗体夹心ELISA及改良一步法等。常为血清和尿液联合检测，或单独尿液检测。直接斑点ELISA具有操作简单、检测结果迅速、可肉眼观察、能长期保存、敏感性高等特点，具有诱人的现场应用前景。但由于直接用肉眼观察，对结果的判断有一定主观性。双抗体夹心ELISA具有较高敏感性和高度特异性，重现性好，使用酶标仪判读结果较为客观，但对实验条件的要求较高、操作反应过程长，不适合于现场应用。(3)影响血吸虫CAg检测的因素：①患者体内CAg的存在状态直接影响CAg的检测效果。②各类CAg在宿主体内代谢消长规律的不同影响检测结果。③血吸虫感染程度不同影响CAg检出率。④感染后期患者体内抗独特型抗体的出现可造成体内CAg存在的假象。

绦虫(tapeworm)目的和要求了解带绦虫和其他绦虫的基本形态和生活史特点。掌握猪带绦虫、牛带绦虫的鉴别要点。了解带绦虫病、囊尾蚴病、棘球蚴病、裂头蚴病对人体的危害。实验内容带绦虫成虫链状带绦虫（猪带绦虫）（Taeniasolium）液浸标本（示教）肥胖带绦虫（牛带绦虫）（Taeniasaginata）液浸标本（示教）注意虫体外形、长度、头节和链体。猪带绦虫头节染色标本：呈圆球状，具四个吸盘，顶端具顶突，顶突上有二圈小钩。（操作）牛带绦虫头节染色标本：近似方形，具四个吸盘，无顶突和小钩。（示教）猪带绦虫成节染色标本（示教）牛带绦虫成节染色标本（示教）两种绦虫成节结构大体相同。每个节片都有雌雄生殖器官，子宫呈管状，无子宫孔，卵巢分两叶，猪带绦虫卵巢另有一中央小叶，缺消化器官。猪带绦虫孕节墨汁染色标本（示教）牛带绦虫孕节墨汁染色标本（示教）子宫两侧的分支数是鉴别两种绦虫的重要依据，通常猪带绦虫孕节每侧分支为7~13支，牛带绦虫为15~30支，枝端再分支。猪带绦虫体壁微毛扫描电镜照片（示教）幼虫猪带囊尾蚴染色标本（示教）牛带囊尾蚴染色标本（示教）两种囊尾蚴头节与成虫头节构造相似，注意两种囊尾蚴的镜下鉴别。猪囊尾蚴在猪心肌内（示教）猪囊尾蚴在猪脑组织及其他肌肉组织内（示教）（三）虫卵（操作）：虫卵呈球形或近球形，直径31~43μm，卵壳甚薄，内为胚膜。虫卵自孕节散出后，卵壳多已脱落，成为不完整虫卵。通常镜检所见的卵无卵壳，外有很厚胚膜，棕黄色，具放射状条纹，内含有六钩蚴，新鲜卵的六钩蚴可见6条关刀样的小钩。两种带绦虫卵形态相似，镜下不能区分。曼氏迭宫绦虫(spirometramansoni)成虫成虫液浸标本（示教）成虫头节染色标本：呈指状，其背腹面各有一条纵行的吸槽。（示教）成节染色标本：成节子宫呈螺旋状盘曲，紧密重叠，似金字塔状。（示教）头节扫描电镜图（示教）中间宿主及幼虫（示教）中间宿主－剑水蚤裂头蚴在第二中间宿主——蛙肌肉内。裂头蚴长带形，乳白色，约300mm×0.7mm，头部膨大，末端钝圆，体前端无吸槽，中央有一明显凹陷，是与成虫相似的头节。体不分节但具横皱褶。（三）虫卵（示教）虫卵近椭圆形，两端稍尖，大小为52~76μm×31~44μm，呈灰褐色，有卵盖，壳较薄，内有一个受精卵细胞和若干卵黄细胞。（四）解剖青蛙找裂头蚴（小组操作）用小锥从枕骨大孔刺入，处死青蛙。使蛙腹朝上，四肢伸展，固定在解剖板上，剪开腹部皮肤，剥去外皮，在肌肉束间寻找裂头蚴，观察幼虫的形态、颜色和活力。细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)成虫染色标本（示教）棘球蚴在肝脏内的液浸标本（示教）原头蚴染色标本：呈椭圆形，具吸盘和细钩。（操作）棘球蚴切片标本（示教）外层是宿主组织的反应物为假囊壁，真囊壁分为内外两层，外层为角皮层，无细胞结构，内层为生发层（胚层），具细胞核和微粒物质，胚层长出原头蚴。作业绘带绦虫虫卵形态图。标注猪带绦虫头节形态图。绘原头蚴形态图。写出解剖青蛙找裂头蚴实验报告。思考：从形态、生活史、致病作用、流行（流行因素与分布）方面比较猪带、牛带绦虫。你认为治愈带绦虫病的依据是什么？参考资料

1.带绦虫头节标本制作方法

把牛肉或猪肉内的囊尾蚴用刀顺肌肉纤维剥下，用生理盐水洗涤干净，投入盛有稀胆汁的器皿中(胆汁一份、生理盐水一份)置37℃温箱内，头节很快伸出。经生理盐水洗涤干净后，用5％福尔马林直接固定，并保存在70％酒精中。2.猫泡带绦虫为家畜带绦虫之一，成虫寄生于猫、狗及其他动物的肠腔内，虫卵随粪便排出体外，污染周围环境。啮齿类动物如食入虫卵，几周后便可在肝脏发育成幼虫。幼虫似猪、牛带囊尾蚴，为囊状、乳白色。由于家畜带绦虫形态与猪、牛带大同小异，因此对教学和科研都有一定用处。在免疫学研究方面，本虫占有很重要的地位。3.实验感染剑水蚤从犬、猫肠内检获曼氏迭宫绦虫成虫，撕开成熟节片的子宫，取出虫卵，置盛有清水的培养皿内，25～28℃培养，约经1～2周孵出钩毛蚴。

将剑水蚤放入盛有钩毛蚴的培养皿内，最好加入藻类及原生动物借以养育剑水蚤。置29℃温箱约7～10天，在剑水蚤的血腔内可找到成熟的原尾蚴。4.孕节墨汁染色标本制作方法用0.1～0.2ml注射器吸取少许墨汁，从孕节生殖孔插入后缓慢注入，使全部子宫分支完全充满墨汁而显示出来。

线虫(nematode)

一、似蚓蛔线虫（蛔虫）(Ascarislumbricoides)目的和要求以蛔虫为例了解线虫形态和生活史基本特点。掌握蛔虫卵形态特征。了解蛔虫对人体的危害。实验内容成虫雌雄成虫液浸标本（示教）成虫为长圆柱体状，中间稍膨大，两端逐渐变细，新鲜虫体呈淡红色，固定后呈灰白色。体表有横纹和两条侧线，雄虫后端向腹部卷曲。雌雄成虫解剖标本（示教）肠管为一直管。生殖器官：细长如线，迂回盘曲。雌性生殖器官为双管型：由卵巢、输卵管、子宫、阴道和阴门等组成。近端为子宫，两侧子宫会合为阴道，远端为卵巢游离在原体腔内。雄性生殖器官为单管型：由睾丸、储精囊、输精管、射精管和交合刺等组成。游离端为睾丸。蛔虫横切面染色标本（示教）注意下列结构：体壁：表皮为角皮层，其下为皮下层和纵肌层，皮下层伸入原体腔内并增厚，背腹及两侧分别形成四条纵索。肠管：肠壁由单层柱状上皮细胞组成。原体腔：即体壁和消化道之间的腔隙，腔内充满液体，内部器官，如生殖、消化器官浸浴其中。虫卵受精蛔虫卵（操作）虫卵呈短椭圆形，大小为45~75μm×35~50μm，卵壳很厚，通常表面有一层波浪式的蛋白质膜，从粪便排出的虫卵常被胆汁染成黄色或棕褐色，内含有一个未分裂的受精卵细胞，与卵壳之间形成半月形间隙。未受精蛔虫卵（操作）虫卵呈长椭圆形或不规则形，大小为88~94μm×39~44μm，卵壳较薄，淡黄色，内含有许多大小不一的屈光颗粒。感染期虫卵（示教）卵内含有一条卷曲的幼虫。受精卵和未受精卵的扫描电镜图。（示教）（三）病理标本（示教）蛔虫性机械性肠梗阻病理标本。蛔虫成虫在胆道内的病理标本。（四）作业绘受精和未受精虫卵形态图。二、毛首鞭形线虫（鞭虫）(Trichuristrichiura)目的和要求掌握鞭虫卵的形态特征。实验内容鞭虫成虫液浸标本（示教）虫体后部粗大，前端细长状似马鞭。虫卵（操作）虫卵较小，50~54μm×22~23μm，纺锤形，黄褐色，卵壳较厚，卵壳两端各有一个透明的塞状突起—盖塞，从粪便排出的新鲜虫卵内含有一个受精卵细胞。鞭虫成虫咬附在肠壁上的病理标本。（示教）作业：绘鞭虫卵形态图。三、钩虫十二指肠钩口线虫（十二指肠钩虫）(Ancylostomaduodenale)美洲板口线虫（美洲钩虫）(Necatoramericanus)目的和要求了解两种钩虫形态的鉴别要点。掌握虫卵的形态特征。掌握与致病作用有关的形态结构。了解钩虫病流行与自然因素和作物种植的关系。实验内容成虫成虫液浸标本（示教）虫体呈乳白色或米黄色，前端向背侧仰屈，雄虫末端膨大形成交合伞。雌雄成虫交配标本（示教）十二指肠钩虫口囊染色标本（示教）注意口囊腹侧有两对钩齿。美洲钩虫的口囊染色标本（示教）注意口囊腹侧有一对板齿。虫卵虫卵（操作）虫卵椭圆形，两端较圆，大小为36～40μm×56～76μm，壳很薄，无色透明，内含2~8个卵细胞或多细胞期，若患者便秘或粪便放置过久，虫卵细胞可继续分裂为多细胞期，有时可见桑椹期甚至含蚴卵。卵壳与细胞间有明显的空隙。十二指肠钩虫卵与美洲钩虫卵极为相似，不易区分。2.发育期虫卵（示教）卵内含有2、4、8个细胞或桑椹期、含蚴虫卵。3.虫卵扫描电镜照片（示教）病理标本成虫咬附在肠壁上（示教）注意肠粘膜表面的小溃疡和出血点。成虫口囊咬附肠粘膜的组织切片（示教）作业绘钩虫虫卵图。标注钩虫口囊形态图。思考：钩虫是如何感染宿主的？对宿主有哪些危害？钩虫病流行与自然环境的关系。比较皮肤幼虫移行症与钩蚴性皮炎。四、蠕形住肠线虫（蛲虫）(Enterobiusvermicularis)目的和要求掌握蛲虫卵的基本形态和实验室诊断方法。实验内容雌雄成虫液浸标本（示教）虫体细小，乳白色，雌虫尾端长而尖细，雄虫尾部弯曲。虫卵（操作）虫卵大小为50~60μm×20~30μm，无色透明，两侧不对称，一侧偏平，一侧稍凸，卵壳厚，内含幼虫。生理盐水棉签拭子法（示教）用生理盐水湿润棉签轻拭肛门周围或皱褶，把棉签放入盛有饱和盐水的西林瓶内荡洗，然后用浮聚法或沉淀法检查虫卵。作业绘蛲虫卵图。思考：为何蛲虫感染多见于群居的儿童？参考资料蛔虫生活史过程验证实验取雌虫一条置蜡盘内，两端拉直，用大头针固定(有生殖孔的一面贴向蜡盘)。自虫体前1／3起至末端将体壁剪开，用大头针固定切口两边。倾入少量清水并用解剖针轻轻将生殖器官松开。剪下连接阴道1.5厘米的子宫下段，置载玻片上撕碎，取少许碎组织加适量生理盐水做成涂片，镜检确定含有受精卵后取用。将充分撕碎的子宫组织放入青霉素瓶内，滴加2％福尔马林液约2毫升，置室温或27℃左右温箱内培养3周，每周取少许培养物检查虫卵的发育情况。待虫卵发育成熟后，用吸管吸去福尔马林液，滴加适量生理盐水做成虫卵混悬液。用吸管吸取0.５毫升，经食道灌喂小白鼠。感染蛔虫卵1周后，解剖小白鼠，取出肺脏置培养皿内，加入少量生理盐水洗去血迹，观察脏器表面有无出血点。然后将组织撕碎做成压片，用双目镜或低倍镜检查蛔虫幼虫。巴门氏钩蚴分离法原理：钩蚴有向温性，在两个不同的温度中，向温度较高的方向爬动。

方法：将被检泥土置于垫有三层纱布的铜筛内，把铜筛放在漏斗中。漏斗下方连接胶管，拧紧止水夹。加温水(约40℃)至漏斗内，使水平面接触铜筛底层泥土。20分钟后开放止水夹，将漏斗底层液体收集在离心管，离心l～2分钟，或静置10～20分钟，倾去上清液，吸取沉渣滴在玻片上，置双目解剖镜下检查钩蚴。3.纱布垫钩蚴分离法用温水(约40℃)湿透纱布垫(6～7层纱布)盖在被检泥土上面，再盖上培养皿。20分钟后取出纱布垫，在清水中荡洗，洗液静置后，吸取沉渣查钩蚴。4.钩蚴培养法(详见教材308页)取干净的中试管一支，加入少许冷开水，剪一“T”字型滤纸，其宽度比试管的直径略小，长度相当于从试管口至水面接触的距离。取粪便0.2～0.4克，均匀地涂在滤纸的中段，置25～30℃培养。培养过程中，每天要补充试管内蒸发去的水份。三天后用放大镜检查管底水中有无幼虫，如果阴性继续培养至第五天。观察时注意：幼虫虫体透明，在水中可作蛇形运动，检查时需仔细观察。5.线虫成虫的固定和保存虫体用生理盐水洗涤后放入固定液内，通常钩虫、鞭虫等用5％甘油酒精(70％酒精95毫升，甘油5毫升)固定，甘油酒精加温后才投入虫体，可令其体态伸直,效果更好，蛔虫虫体较大，用5％福尔马林液固定。(2)上述固定液又可作保存液。此外，亦可保存在70％酒精中。6.虫卵玻片标本的制作(1)虫卵的固定：将收集的虫卵洗涤干净后，根据虫卵的种类选择固定液和固定方法。含有幼虫的虫卵可直接倾入固定液内浸泡，24小时后更换固定液，即可保存。含细胞的虫卵则先将固定液煮沸、然后倾入虫卵，浸泡24小时后更换固定液保存。常用固定液：5％福尔马林、5％甘油酒精。虫卵玻片标本制作：吸取一滴已经固定的虫卵混悬液，置大盖玻片中央，四周放上数粒碎玻璃，盖上小盖玻片，轻压无液体溢出，然后在载玻片上滴加拿大树胶2～3滴，把盖玻片封于其上。平放自然干燥。此法制出的标本可保存较长时间。7.司徒尔氏稀释虫卵计算法本法用作调查感染度。取刻有56和60毫升刻度的三角烧瓶一个，加入0.1NNaOH溶液至56毫升刻度处，加被检粪便于烧瓶内，使瓶内液面上升至60毫升刻度处(相当于4克粪便)投入10多个小玻璃球于瓶内，塞紧瓶口，用力摇荡。二个小时后，充分摇匀，吸取0.15毫升粪便悬液致载玻片上，盖上大的盖玻片，在低倍镜下计算出全玻片虫卵数,最好连数两张，求得平均虫卵数。每克粪便中的虫卵数＝0.15毫升粪便悬液中检出的虫卵数×100由于粪便中的虫卵数受粪便性状的影响，对稀粪中所求得的虫卵数应以纠正：半成形粪便×1.5软便×2稀便×2水样便×4

五、丝虫(filaria)马来布鲁线虫（马来丝虫）(Brugiamalayi)班氏吴策线虫（班氏丝虫）(Wuchereriabancrofti)目的和要求了解丝虫生活史和流行病学特点。掌握微丝蚴的基本形态。了解病原学诊断方法。实验内容成虫马来丝虫成虫液浸标本（示教）班氏丝虫成虫液浸标本（示教）罗阿丝虫(Loaloa)成虫液浸标本（示教）犬恶丝虫(Dirofilariaimmitis)成虫液浸标本（示教）微丝蚴马来丝虫微丝蚴染色标本（操作，示教）班氏丝虫微丝蚴染色标本（操作，示教）注意虫体外形、姿态、鞘膜、头间隙的长宽比例、体核等，在示教标本中注意马来丝虫微丝蚴有尾核2个。微丝蚴未染色标本（示教）微丝蚴细长弯曲或卷曲，反光性强，头端钝圆，尾端尖细，观察时光线不要太强。班氏丝虫腊肠期幼虫在蚊的胸肌内（示教）班氏丝虫感染期幼虫在蚊喙内（示教）丝虫中间宿主致倦库蚊（示教）中华按蚊（示教）（四）丝虫病病人照片（示教）下肢象皮肿。睾丸鞘膜积液和阴囊象皮肿。作业标注微丝蚴形态图。思考：1.班氏丝虫病的流行有何特征？为什么？2.两种丝虫的致病特点。六、旋毛形线虫（旋毛虫）(Trichinellaspiralis)目的和要求掌握幼虫囊包的形态特点和病原学诊断方法。通过动物实验了解生活史和致病作用。实验内容幼虫囊包染色标本（示教）幼虫囊包活体标本（示教）动物感染和解剖实验（小组操作）感染方法：(1)取感染6周的阳性小白鼠，处死取一小块肌肉压片检查，并计算囊包数。(2)将含有约30个囊包的肌肉喂给小白鼠。(3)正常饲养。解剖观察：(1)将已感染旋毛虫幼虫囊包6周的小白鼠处死解剖。(2)取小白鼠小肠，剪开并用清水洗涤、轻刮，在洗涤液的沉渣中找成虫。(3)取膈肌、颊肌、腿部肌肉等，压片找幼虫囊包。作业绘旋毛虫幼虫囊包形态图。写出动物感染和解剖实验报告。思考：1.有哪些家畜可作为人体寄生虫的保虫宿主？2.生物源性线虫和土源性线虫的流行分布有何不同？为什么？参考资料厚血膜检查法用75％酒精消毒采血针和受检者耳垂，以左手拇指和食指捏着耳垂上方、右手持针，迅速刺人耳垂约3毫米，轻轻挤压取出血液三大滴（相当于60mm3），置载玻片两侧中、外1／3处，用另一载玻片的一角将血液从内向外作螺旋状推开，做成两个二分钱硬币大小的血膜，将玻片平放，待自然干透后，用铅笔在两个血膜的边缘写上编号，收藏在玻片盒内，检查时将玻片放入清水中片刻，脱去血红蛋白，待血膜呈乳白色时取出镜检。新鲜血滴检查法取末梢血二大滴（最好加入1/100，000肝素一滴）置载玻片中央，加上盖玻片后，在低倍镜下检查。微丝蚴在血液中扭动，推挤周围红细胞。实验材料取自病人或动物。血液微丝蚴浓集法取静脉血1ml，置于盛有0.1ml3.8％枸橼酸钠溶液的离心管内，摇匀，加入蒸馏水9ml，使之溶血，以3000转／分钟的速度离心2分钟，倾去上清液取沉渣镜检。马来丝虫幼虫在中间宿主体内发育过程的实验观察(1)从实验室建立的保虫宿主—长爪沙鼠的腹腔内穿刺吸出含有微丝蚴的腹腔液。(2)取抗凝血（人或动物血）5～10ml，离心后去血浆，用生理盐水洗涤红细胞2～3次。(3)将含有微丝蚴的腹腔液加入5～10ml红细胞生理盐水混液中，用玻棒轻轻搅匀。(4)用完整的胎盘膜一块做成囊袋，吸取红细胞与微丝蚴混合液置胎盘膜囊袋中，牢固结扎袋口。(5)将囊袋置于饲有雌性中华按蚊的蚊笼内，在25～30℃条件下，让雌蚊吸食。(6)大多数雌蚊吸饱后，取出囊袋，改用10％葡萄糖湿棉球，继续饲养。(7)4～6小时后，取部分饱食后的雌蚊麻醉致死，解剖，取出蚊胃并挑破胃壁挤出血液，加一滴生理盐水稀释，找微丝蚴，观察微丝蚴的脱鞘情况。(8)于第3天，取部分蚊解剖胸肌，查找粗短的形似腊肠的幼虫。(9)2～3周后取出余下的蚊解剖，在喙和体腔内找虫体细长、运动活泼的感染期幼虫。旋毛虫幼虫囊包浓集法将被检肌肉剁成小块，用研钵磨成匀浆，倒入烧杯内，加适量胃蛋白酶消化液，37℃温箱内消化16～20小时，倾去上清液，加入生理盐水，过滤除去粗渣，沉淀后收集幼虫。6.广州管圆线虫广州管圆线虫[Angiostrongyluscantonensis（Chen,1935）Dougherty,1946]寄生于鼠类肺部血管。偶可寄生人体引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。中间宿主为螺类及蛞蝓。成虫线状，体表具微细环状横纹。头端钝圆，头顶中央有一小圆口，缺口囊。雄虫长11~26mm,宽0.21~0.53mm，交合伞对称。雌虫长17~45mm，宽0.3~0.66mm,尾端呈斜锥形，子宫双管形、白色，与充满血液的肠管缠绕成红、白相见的螺旋纹，十分明显，阴门开口于肛孔之前。七、肠道寄生虫病原学检查目的和要求掌握常用粪便检查方法。自检粪便、驱虫。实验内容（一）粪便直接涂片法（示教）在玻片上滴生理盐水一滴，用竹签挑取米粒大小粪便均匀涂片，盖上盖玻片，置低倍镜下检查。注意：(l)粪便量要适中。粪便过多，则涂片太厚不利于观察；粪便太少，则涂片薄影响检出率。制好的涂片以透过水膜能隐约看到课本的字体为适宜。(2)粪便中含有各种植物细胞，酵母菌、花粉、植物纤维和未完全消化的食物残渣等，容易与虫卵混淆，必须注意鉴别。(3)制好的涂片不能干燥，否则不易辨认虫卵。（二）饱和盐水浮聚法(示教)取粪便约黄豆大小置小玻璃瓶内，先加入少许饱和盐水，将粪便搅成糊状,再加饱和盐水至满，盖上载玻片使液面与玻片接触，如有粪渣或气泡必须除去。静置20分钟后，小心翻转取下玻片，擦干玻片下面的水份。置镜下检查。（三）清水沉淀法(示教)(1)取粪便约5～10克置小烧杯内，加水少许，用玻璃棒搅成糊状，并加水稀释。(2)倒入铜筛(或塑料纱网)内过滤，滤去粪渣，并把滤液倾入大试管内，加水至将满。(3)静置10～15分钟。(4)倾去上层液4／5，留粪渣，加水，静置5～10分钟，如此换水数次，直到上清液澄清为止，最后倾去上层液体，吸取沉渣镜下检查。参考资料厚涂片透明法(改良加藤法)：

一、所需工具

1．定量板及刮棒；

2．100目尼龙或金属筛网片(大小约4×4cm)；

3．亲水玻璃纸条(约5.2×2.6cm)，浸泡于甘油孔雀绿液(3％孔雀绿1ml，甘油50m1，水49ml)中过夜后用；4．压板(厚玻璃或有机玻璃制品，大小为5×3cm，可连续使用)；5．载玻片及显微镜。二、操作步骤1.滤取粪便：将筛网覆盖在送检标本上，自筛网上用刮棒刮取挤溢到网面上的粪便。2.模板取样：将定量板放在载玻片上，使小边突紧贴玻片的一边，用一手的两指压住定量板的一端，将刮棒上取得的粪便填满模孔，刮去多余部分，然后自一端掀起定量板，再松开压住的两指把板取去，玻片上即留下二个长条形粪样。3.盖纸压片：在粪条上覆盖含孔雀绿甘油液的玻璃纸条，展平后用压板加压，粪样即在玻璃纸与载玻片间铺开成长椭圆形，小心取下压板(一指固定压板外的玻璃纸的一端，另一手平拖移去压板，以免玻璃纸与压板同时揭起)。4.透明读片：约1～2小时粪膜透明后即可读片。钩虫卵不宜透明过久。

医学原虫(medicalprotozoan)溶组织内阿米巴和其它阿米巴目的和要求掌握溶组织内阿米巴滋养体和包囊的形态特点。掌握溶组织内阿米巴常用诊断方法。理解溶组织内阿米巴的致病作用。掌握溶组织内阿米巴与结肠阿米巴形态鉴别要点。实验内容溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)滋养体(trophozoite)(l)铁苏木素染色标本(操作和示教)

先用高倍镜找到虫体，然后用油镜观察，或直接用油镜寻找。虫体外质透明，可见舌状或指状伪足，内质呈颗粒状，颗粒细小而均匀，内有一个核，圆形，核膜内缘的染色质粒大小较一致，排列整齐，核仁小而圆，位于中央。部份滋养体内质含有红细胞，红细胞的形态随消化程度不同而异。有些滋养体内质还含有空泡。(2)活滋养体观察(操作)方法：取一洁净玻片，中央滴一滴生理盐水，挑取有脓血粘液的粪便少许，在生理盐水中混匀，涂开，盖上盖玻片。高倍镜下检查。活滋养体的外质透明，伸出指状或舌状伪足作定向运动，使虫体形态不断发生变化。内质可见细胞核和内含物。如果标本取自培养液，虫体内可含有许多淀粉颗粒。注意：如果天气寒冷，取得的标本要立即检查或保温处理，否则原虫的活动力减弱。检材应挑取有脓血部份，可提高检出率。2.包囊(cyst)铁苏木素染色标本（操作和示教）包囊呈圆球形，染成蓝黑色。囊壁厚，不着色。核通常1～4个，成熟包囊具4个核，核结构与滋养体相同，糖原泡在染色时被溶解，成为空泡，拟染色体深蓝色，棒状，两端较钝圆。成熟包囊常缺拟染色体。(2)碘液染色标本(操作和示教)

挑取少许粪便制成涂片，加上盖玻片，在盖玻片旁边滴一滴碘液(碘液不宜过多)，使碘液慢慢掺到粪液中，置高倍镜下观察。

染色后包囊呈棕黄色，圆球形，囊壁不着色，发亮。核呈小圆圈状、糖原泡着色较深，边界不明显。拟染色体呈亮捧状。3.病理标本(l)肠阿米巴病理标本(示教)肠壁溃疡呈散在性分布，大小不一，病变中央组织缺损，周围组织水肿而隆起，形成火山口样。多个溃疡融合后，使少块肠粘膜组织坏死、脱落，形成浅表溃疡。溃疡口小底大，溃疡之间仍可见到正常组织。(2)肠阿米巴病理组织切片(示教)在溃疡周围组织可见到滋养体、大量白细胞浸润。经HE染色，滋养体染成桃红色，胞核和吞噬的红细胞染成深桃红色。(3)阿米巴肝脓肿病理标本(示教)脓肿多发生在肝右叶，常为单个，脓腔周围组织坏死，使腔壁不整齐，呈棉絮状。4.滋养体和包囊扫描电镜照片(示教)结肠内阿米巴(Entamoebacoli)1．滋养体铁苏木素染色标本(示教)较溶组织内阿米巴的滋养体略大，内质、外质分界不甚明显，食物泡内含有细菌和淀粉颗粒等，但不含红细胞。核仁常常偏于一边。核膜内缘的染色质粒粗而不均匀，排列不整齐。2.包囊铁苏木素染色标本(示教)较溶组织内阿米巴的包囊大，圆球形，胞核1～8个，核构造和滋养体相似。拟染色体的两端不整齐似碎片状或草束状。（三）腔道内其他非致病性的阿米巴(示教)1.齿龈内阿米巴(E.gingivalis)滋养体虫体小，仅有滋养体时期，内质和外质的界限分明，食物泡内含有细菌、白细胞等物，偶有红细胞，核仁居中，有核周染色粒。2.微小内蜒阿米巴(E.ndolimaxnana)滋养体：新鲜标本直接涂片中虫体细小。运动缓慢，可有多个伪足。胞核一个，内外质不分明，内质粗糙，含有细菌。有一粗大明显核仁,无核周染色质粒。包囊：较溶组织阿米巴细小，类圆形或椭圆形，核1～4个，核仁粗大而不规则，核膜薄，无核周染色质粒，缺拟染色体。3.布氏嗜碘阿米巴(Iodamoebabuetschlii)滋养体：虫体细小，新鲜标本生理盐水涂片中伪足宽大，运动缓慢。食物泡内含有细菌，染色标本中核仁大而且居中央，核膜内缘的染色质粒不明显。(四)作业绘溶组织内阿米巴滋养体和包囊形态图。绘结肠内阿米巴包囊形态图。思考：痢疾阿米巴病是怎样传播的？如何作肠阿米巴病和肠外阿米巴病（肝）的病原学诊断？参考资料阿米巴培养方法：取液体培养基一管，加入灭活血清0.5毫升和少许消毒米粉以及6滴青霉素液，在无菌操作条件下，用吸管吸取0.1毫升含有滋养体的培养液，转种入培养基内，置37℃温箱内培养48～72小时。

二、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)目的和要求掌握滋养体和包囊的形态特征。了解病原学诊断方法。实验内容滋养体铁苏木素染色标本（操作）正面观似半个纵切的倒置梨形，侧面观呈瓢状。两侧对称，背面隆起，腹面前半部向内凹陷形成左右两叶吸盘，每叶吸盘的背侧备有一个圆形的泡状细胞核。一对轴柱纵贯虫体，中部有2个半月状中体。鞭毛4对，按伸出虫体的部位分前侧鞭毛、后侧鞭毛、腹鞭毛和尾鞭毛各一对。2.包囊铁苏木素染色标本(操作)包囊呈卵圆形，囊壁很厚，不着色。两对核偏于一端，核仁清晰，并可见到鞭毛、轴柱及丝状物。蓝氏贾第鞭毛虫吸附在肠粘膜表面的扫描电镜图（示教）4.作业绘蓝氏贾第鞭毛虫滋养体、包囊形态图。思考：蓝氏贾第鞭毛虫为何可致宿主腹泻？三、阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis)目的和要求掌握阴道毛滴虫的形态。实验内容1.阴道毛滴虫滋养体染色标本（操作）虫体呈梨形或椭圆形，轴柱贯穿虫体并从末端伸出，虫体前1/3处可见一个椭圆形胞核，从虫体前缘发出4根前鞭毛和1根后鞭毛。体外侧前1/2处有一波动膜，其外缘与向后延伸的后鞭毛相连。胞质内可见深染、颗粒状的氢化酶体。阴道毛滴虫活滋养体（示教）活滋养体呈无色透明状，有折光性，体态多变，活动力强。3.作业：绘阴道毛滴虫滋养体图。参考资料1.阴道毛滴虫的培养常用肝-胨-糖培养基的培养配方。

(1)培养基的配制：15％肝浸液100ml；蛋白胨2g；葡萄糖0.5g。将以上成分混合，加热使溶，经滤纸过滤，调节pH至5.5～6.0。每管分装5m1,8磅20分钟高压灭菌，冷却后，置37℃恒温箱中24小时，证明无菌后，贮存于冰箱备用。接种前每管加灭活无菌马血清1ml,即可用。15%肝浸液的制备：取牛或兔肝15g,洗净，剪碎如小米粒大小，浸入100ml蒸馏水中，置冰箱过夜，次日煮沸半小时，用四层纱布过滤除去渣滓，补充蒸馏水至100ml,即成15%肝浸液。培养方法①以无菌棉拭从阴道后穹隆处取分泌物，无菌接种入上述的培养基中；②初次接种和第1、2次转种时，应加青霉素5～10万单位／2ml培基；③培养温度以37℃为宜；④PH在5.4～6.8之间。

2.直接涂片法检查阴道毛滴虫用消毒棉签在患者阴道后穹窿及阴道壁上取分泌物，涂在滴加生理盐水的载玻片上，加盖玻片，镜检，可见活滋养体。杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)目的和要求掌握无鞭毛体的形态特征。了解病原学诊断方法。从寄生部位理解致病作用。实验内容无鞭毛体染色标本（操作）骨髓涂片染色，在巨噬细胞内或细胞外有许多分散或成堆集在一起的虫体，选择细胞外的散在虫体仔细观察。虫体细小，圆形或椭圆形，姬氏染色标本中，胞质呈天蓝色，胞核一个，团块状，呈红色，动基体呈小杆状，基体和鞭毛根不易见到。前鞭毛体染色标本（示教）虫体窄而细长，前端稍宽，后部窄细，成熟虫体呈梭形，前端有一游离鞭毛，与虫体等长，体核靠近中部，基体在动基体之前，并由此处发出一根鞭毛。媒介－白蛉（示教）作业绘无鞭毛体形态图。思考：如何诊断（用病原学方法）疑为内脏利什曼病的患者？参考资料1.利什曼原虫培养检材取自病人或实验动物的骨髓、淋巴结、肝、脾(固体组织要磨碎成匀浆)。用0.2毫升洛克氏液混和后接种到NNN培养基，置22～25℃温箱培养10～12天。阳性结果见到运动活泼的前鞭毛体。2.活前鞭毛体的观察从培养基内吸一滴培养液置载玻片上，加盖玻片后，用高倍显微镜观察，可见虫体活泼运动，鞭毛快速挥动，多个虫体常集在一起呈菊花状。3.骨髓穿刺法患者侧卧，显露髂骨部位，常规消毒铺巾，局部麻醉，依据年龄选择17～20号带有针芯的消毒穿刺针，在髂骨前上棘后约1厘米处进针，触及骨面后，慢慢钻入骨内约0.5～1.0厘米，拨出针芯，接上2ml注射器，抽取骨髓液少许作涂片或培养。4.淋巴结穿刺法该法诊断利什曼原虫的检出率不及骨髓液检查高，但简便易行，常用部位为腹股沟淋巴结。患者平卧，显露腹股沟部，常规消毒铺巾，局麻后，用拇指和食指压紧肿大的淋巴结，取6号消毒针刺入淋巴结内，稍待片刻拨出针头，取抽出液作涂片或培养检查。5.路氏锥虫（TrypanosomalewisiKent,1880）路氏锥虫寄生在鼠类血液内，中间宿主为欧洲鼠蚤(Ceratephyllusfasciatus)。由于取材容易，多用之作研究对象。本虫分布广泛，我国各地均有报告。在鼠血液中的虫体梭形纤细，长约25μm。有细胞核和动基体各一个，细胞核居中，动基体位于虫体后部近末端。有鞭毛一条附着于波动膜外缘，由前端伸出体外，在血液中鞭毛甚为活泼。

五、疟原虫(malariaparasite)目的和要求学习疟原虫生活史，理解疟原虫的致病机理。掌握疟原虫病原学诊断方法及三种疟原虫的鉴别要点。初步了解疟原虫的媒介—按蚊。认识疟疾的防治要点。学习研究疟原虫的基本方法。实验内容红细胞内期疟原虫1.间日疟原虫(Plasmodiumvivas)（操作和示教）(1)环状体:纤细环状，直径约占红细胞的l／3。染色后胞质蓝色，有一深红色的核,中间为空泡，形似红宝石戒指。(2)滋养体：核略增大，形态视发育时间和活动情况而多变，可见伪足，胞质内有黄棕色烟丝状疟色素，被寄生的红细胞略胀大，染色变淡，并出现淡红色的薛氏点。(3)裂殖体：早期裂殖体只见核分裂而无胞质分裂。成熟裂殖体含12～24个椭圆形裂殖子，排列不规则，疟色素集中在中央。虫体占满胀大的红细胞。(4)配子体雄配子体：圆形，略大于正常红细胞，胞质色蓝略带红，核疏松，淡红色，位于中央，疟色素分散。雌配子体：圆形，占满胀大的红细胞，胞质蓝色，核结实，较小，深红色，偏于一侧，疟色素分散。2.恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)（操作和示教）(1)环状体：(需与间日疟原虫比较)

虫体小，直径约为红细胞的1／5，常见多个虫体寄生在一个红细胞内，且有虫体寄生在红细胞的边缘，一个虫体有2个核较常见。(2)配子体雄配子体：腊肠形，两端钝圆，胞质色蓝略带红，核位于中央，疏松、淡红色,疟色素黄棕色，小杆状，在核周围较多。雌配子体:新月状，两端较尖。胞质蓝色。核位于中央，结实，较小，深红色。疟色素深褐色，多在核周围。3.三日疟原虫(Plasmodiummalariae)（示教）环状体：环较粗大，约为红细胞直径的1／3。滋养体：胞质横贯红细胞呈带状或卵圆形，胞质内少有空泡，几乎看不见伪足,胞质分布不均匀，疟色素出现较早，深褐色，呈颗粒状，且沿虫体边缘分布。被寄生的红细胞大小无改变。裂殖体：成熟裂殖体含有6～12个裂殖子，排列规则，呈花瓣状，疟色素集中在中央。颗粒粗大，呈深棕色。配子体：与间日疟原虫配子体相似。但虫体的外形较规则，多呈圆形。疟色素多而粗大。红细胞大小无改变。（二）红细胞外期疟原虫（示教）1.蚊体内发育的疟原虫。2.卵囊：圆球形或椭圆形，内含有许多子孢子。3.子孢子：梭形，两端尖细，大小约为1×8μm，姬氏染色核红色，胞质天蓝色。（三）血涂片制作及染色（操作）1.在同一张玻片上制作厚血膜和薄血膜

血液取自人工感染伯氏疟原虫的小鼠。剪去其尾尖，挤出2小滴血，分两处置于载玻片同一端，相隔约1厘米。然后以左拇指和食指握持玻片的两端，右手持推片(边缘要光滑)，以推片一个角将外侧的一滴血均匀涂成直径0.5cm大小的血膜,此为厚血膜。再将推片的短边接触另一滴血，并使推片与载片成30～450角，待血液沿推片下缘散开后，匀速快捷向前推进，即成薄血膜。理想的薄血膜应是血量和宽度适中,平滑不起波浪，末端成扫帚状。厚血膜晾干后进行溶血处理。2.染色：用姬氏染色法(1)原理:染液为含有亚甲蓝(带阳电荷)和曙红(带阴电荷)的中性染料，与细胞蛋白质阳电基、阴电基相遇时，两物质中的阳电荷、阴电荷分别互相吸引而结合，形成碱性和酸性的染色。碱性呈蓝色，酸性呈红色。(2)方法:滴一滴甲醇液于血膜上，推开覆盖所有薄血膜和厚血膜。晾干后，滴加20％姬氏染液(用中性水配制)于薄血膜和厚血膜上，使全部血膜均被覆盖，染色30～60分钟，用自来水缓慢地冲洗、晾干，油镜下检查。（四）鼠疟原虫（伯氏疟原虫Plasmodiumberghei）接种实验（小组操作）取已感染鼠疟原虫的小白鼠一只，从眼眶、尾巴或心脏取血0.2ml，用生理盐水稀释到1ml，摇匀。用结核菌素注射器吸取0.1ml稀释的含原虫血液，在无菌操作的条件下，给健康小白鼠作腹腔内注射。感染后，作标记并置饲养笼内喂养，留待下周实验使用。（五）疟疾媒介－按蚊（示教）中华按蚊、微小按蚊、大劣按蚊。裂殖子扫描电镜图（示教）(七)作业绘制间日疟原虫各期和恶性疟原虫环状体、配子体期形态图。写出鼠疟原虫感染实验报告。思考：何为疟疾的临床发作、再燃和复发。2.疟疾的流行特征。参考资料间接荧光抗体试验抗体—兔抗人IgG荧光抗体。使用时用pH8.0,0.01MPBS稀释至工作浓度(约1：8或1：16)抗原标本：新发作的同种疟原虫病人的血涂片，干后置0.1NHC1液中脱血5分钟。流水冲洗后置上述PBS内浸泡5分钟，取出风干。被检血清：用上述PBS将被检血清稀释为1：20。染色。吸取被检血清一滴，滴于已脱血的干燥抗原血膜上，铺开，置保湿盒内，于37℃温箱中孵育30分钟。②用上述PBS冲洗一分钟后，重复两次，每次5分钟。取出并风干。③滴加兔抗人IgG荧光抗体（稀释为1：8或1：16，含1／万伊文思蓝）于已作抗原抗体反应的血膜上。置湿盒内，于37℃温箱内孵育30分钟。④同第②步洗去多余的荧光抗体。⑤染好并干燥的血片标本，用pH8.5或8.0的碳酸盐(或磷酸盐)缓冲甘油封片。也可在血标本上加一小滴PBS(pH8.0)覆以盖玻片后作荧光镜检查。(5)结果判断标准：根据裂殖体和滋养体的荧光强度分级。+++～++++：原虫胞浆荧光明亮。形态结构清楚。++：原虫胞浆荧光一般明亮，形态结构清楚。+：原虫胞浆清楚可见，形态结构不太清楚。±：原虫胞浆不显荧光。在血清稀释度为1：20时，+以上的荧光强度为阳性反应。2.疟原虫在蚊体内的发育实验观察本实验是观察鸡疟原虫在白纹伊蚊体内的发育过程。将雌性白纹伊蚊一批置蚊笼内饥饿l天(仅用清水饲养)，次日用人工膜喂血法使蚊媒吸饱带有配子体的鸡血(取自保种鸡)。喂食后2小时把蚊媒吸出，分别置1、2、3号蚊笼内，在25～28℃和75～90％相对湿度下，用10％葡萄糖水喂养。吸血后3～4小时，将l号蚊笼内的蚊媒吸出麻醉致死，解剖，将蚊胃移到干净处，撕破胃壁，挤出血液，把血液做成涂片、染色、镜检、可见雄配子体的出丝现象。吸血后的第4～5天，解剖2号蚊笼内的蚊媒，将胃移至干净玻片上，加一滴生理盐水，加上盖玻片，置镜下检查卵囊。(先在低倍镜下用解剖针轻轻推动盖玻片，使胃壁翻转一周，检查到卵囊时再用高倍镜观察。)(5)轻轻按住卵囊使之破裂，子孢子逸出，染色，油镜观察。(6)吸血后约10天，解剖3号蚊笼的蚊媒，分离唾液腺，移至干净玻片上，用解剖针将之挑破，并轻轻挤压，在高倍镜下观察。子孢子呈镰刀状，两端尖细，有折光性，微弱运动。观察活体之后再用姬氏液染色。3.疟疾诊断方法以镜检为基础，通过浓集血样中的原虫以及采用荧光染色的方法。传统的镜检方法普及性和稳定性较高，在目前条件下尚难以其他方法全部代替之。免疫学方法。主要利用单克隆抗体技术，使疟疾的检测更趋简单、快速，如Dipstick及胶体金等方法。单克隆抗体-ELISA方法虽在大样本的检测中花费最少，但其稳定性较差；Dipstick(ParaSight-F)方法即以单克隆抗体检出HRP-Ⅱ作为恶性疟原虫诊断依据，检测单个病例速度快、稳定性也较好，可能是今后大规模疟疾防治工作或在疟疾防治力量薄弱地区应用的方向。以分子生物学为基础，通过制备特异性的探针与疟原虫的基因组DNA进行杂交即探针技术。通过基因扩增，检测疟原虫某特异片段的DNA序列，从而大大提高检测的敏感性和特异性，如PCR-ELISA等。PCR技术适用于疟原虫不同地理株的鉴别及抗药性的判定，但由于对实验室要求较高，目前尚难普及。限制性片段长度多态性（RFLP）也已成为一种常用