脂质的生物学功能

脂质的生物学功能

20世纪90年代末，代谢组学开始发展为基因组学、可接近组学和蛋白质组学。由于代谢的多样性和复杂性，很难使用一种方法来清楚所有代谢的同时检测。因此，研究人员使用代谢的特异性对其进行分类研究，形成了各种代谢组学分支，如脂质代谢组学、糖代谢组学和养分代谢组学。脂质代谢组学(lipidomics)作为最重要的代谢组学分支,是最近几年研究的热点。新技术、新方法的不断发展,为研究生物体脂质代谢提供了良好的技术支持。2003年7月,华盛顿大学医学部的Han等正式提出了脂质代谢组学的概念——从系统水平上研究生物体内的脂质,揭示其相互作用及与其他生物分子的作用,从而兴起了一门研究脂质代谢调控在各种生命现象中作用机制的新学科。随后VanMeer教授和新加坡国立大学的Wenk又分别在EMBOJournal和NatureReviewsDrugDiscovery上详细阐述了脂质代谢组学发展现状、存在问题和未来方向。生物体内重要的生命活动都离不开脂质,如物质运输、能量代谢、信息传递及代谢调控等。脂质具有多种重要的生物学功能,脂质代谢异常可引发诸多人类疾病,包括阿兹海默症、糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化等。本文就脂质的代谢与分类、脂类代谢组学的概念、研究方法和研究进展进行了概述,以期引起人们对脂质代谢组学研究的关注。1脂质的分类与代谢1.1acylus、甘油类、糖类、多聚乙烯类脂质是生物体内重要的一大类化合物,它们在结构上有很大的差别,但是却有着共同的特点,即:不溶于水,而溶于乙醚、氯仿和丙酮等非极性有机溶剂中。最近,有人采用新的分类方法将脂质大体分为8大类,即:脂肪酸类(fattyacyls)、甘油脂类(glycerolipids)、甘油磷脂类(glycerophospholipids)、鞘脂类(sphingolipids)、固醇脂类sterollipids)、孕烯醇酮脂类(prenolipids)、糖脂类(saccharolipids)、多聚乙烯类(polyketides)。采用这种分类,可以将大类分成不同的亚类和亚亚类,适合于区分新发现的脂肪种类,每种脂肪酸有自己的“脂质身份证(lipidID)”,它由12个数字组成,包括数据库来源(2个数字)、分类号(2个数字)、亚类号(2个数字)、亚亚类号(2个数字)以及唯一的识别码(4个数字)。根据这种命名方式,可以分别为168万种不同的脂质进行身份确认。1.2脂肪酸水解小分子脂质代谢是指生物体内摄入的大部分脂肪经胆汁乳化成小颗粒,胰腺和小肠内分泌的脂肪酶将脂肪里的脂肪酸水解成游离脂肪酸和甘油单酯(少量完全水解成甘油和脂肪酸)。水解后的小分子,如甘油、短链和中链脂肪酸,被小肠吸收进入血液。甘油单酯和长链脂肪酸被吸收后,先在小肠细胞中重新合成甘油三酯,并和磷脂、胆固醇和蛋白质形成乳糜微粒(chylomicron),由淋巴系统进入血液循环。2脂质代谢组学的研究进展各种组学(omics)的迅速发展推动了以研究包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学在内的系统生物学的产生。不同组学间的关系如图1所示。代谢组学作为继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的系统生物学的一个新的分支,它研究生物体系(细胞、组织或生物体)受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化的科学,研究对象主要是相对分子质量1000以下的内源性小分子。由于代谢物的多样性及复杂性,很难用1种方法就将所有的代谢物1次检测清楚,所以根据代谢物的特异性对它们进行分类研究,从而形成了一系列代谢组学的分支,如脂质代谢组学、糖类代谢组学、毒素代谢组学等。脂质代谢组学能与基因组学及蛋白质组学相互结合相互补充,对生物现象进行不同层次的分析,加深对生命本质的了解。Han等首次提出了脂质代谢组学的概念,脂质代谢组学是研究生物体内所有脂质分子的特性,以及它们在蛋白质表达和基因调控过程中的作用的学科。此后,脂质代谢组学的研究逐渐得到了国内外科研工作者的重视。国内外先后成立了脂质组学研究机构并设立研究项目。国际上已有多个组织或研究机构在联合开展脂质代谢组学的研究工作。而且研究的策略更加注重于联合型的规模性研究,更加体现出资源共享性和策略综合性。如美国于2003年设立“脂质代谢物和代谢途径研究策略(lipidmetabolitesandpathwaysstrategy,LIPIDMAPS)”联合项目等。在国内,中国科学院大连化学物理研究所、军事医学科学院、北京大学、清华大学、浙江大学、华东理工大学等单位也正在开展脂质代谢组学方面的研究。自2003年提出到现在,脂质代谢组学已经出现了许多研究分支,如:研究细胞实验的细胞脂质代谢组学(cellularlipidomics)、以计算机辅助分析的计算机脂质代谢组学(computationallipidomics)、研究脂质氧化的氧化脂质代谢组学(oxidativelipidomics)、研究脂质中的类二十烷酸的类二十烷酸脂质代谢组学(eicosa-nomics)、研究脂质手性目标的手性脂质代谢组学(targetedchirallipidomics)、研究由多不饱和脂肪酸转变成脂质调节介质的调节介质脂质代谢组学(mediatorlipidomics)、研究特定脂质之间以及脂质和蛋白质之间相互作用的功能脂质代谢组学(functionallipidomics)以及神经脂质代谢组学(neurolipidomics)等。在脂质研究受到重视的同时,脂质代谢组学的研究方法和研究技术也取得了突破性进展,如薄层色谱法、气相色谱质谱联用法、电喷雾电离质谱法、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法和核磁共振法、鸟枪法等都被运用于脂质的识别鉴定、量化、结构鉴定和功能来研究脂质代谢组学。目前,脂质代谢组学在分析鉴定脂质及其代谢物、研究脂质功能与代谢调控以及绘制脂质代谢途径及网络等三大基础研究取得快速进展的同时,脂质代谢组学在脂质代谢疾病的预防、控制及诊断、脂质生物标志物、药物靶点的鉴定以及药物的研发等方面都取得了重要的进展。3脂质代谢组学近年来,随着大量先进技术的发展以及研究方法的改进,并且不断地将其引用到脂质代谢组学的研究中,推动了脂质代谢组学的快速发展。脂质代谢组学的研究主要包括脂质的提取、脂质的分离、脂质的分析检测和相关的生物信息学技术,其试验的策略见图2。其中核心技术就是电喷雾电离质谱(ESI/MS)技术。联合其他色谱等技术使脂质的分析实现了高通量,高效率,高灵敏度。3.1固相萃取法脂质存在于细胞、细胞器和细胞外的体液如血浆、胆汁、乳、肠液、尿液中。若要研究某一特定部位的脂质,首先要将这部分组织或细胞分离出来。由于脂质不溶于水,通常采用有机溶剂进行提取。传统的提取剂是氯仿、甲醇和水(1.0∶2.0∶0.8)的混合液。这种比例的混合液是混溶的,形成1个相。所需的样品在这种混合液中提取所有脂质,向提取液中加入过量的水使之分成2个相,上面是甲醇和水,下面是氯仿。脂质就留在氯仿相,蒸发浓缩后,取之干燥就得所需脂质。这种脂质提取方法,能够提出组织样品中的总脂。也有人采用甲基叔丁酰乙醚(methyl-tert-butylether,MTBE)提取样品中的脂质。这种方法降低了脂质的损失率,操作简便,而且提取效果较好。对于只检测总脂中的部分脂质,固相萃取(SPE)是一种较好的方法。固相萃取也称作液-固萃取,是在液相色谱理论基础上建立的分离纯化方法,利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰物分离,然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附,达到分离和富集目标化合物的目的。它可分为正相、反相、离子交换和吸附。使用最多的固相萃取介质是C18固相萃取小柱,另外还有氰基键合相柱(CN)以及离子交换柱和吸附树脂柱。固相萃取技术设备要求低,操作简单,能快速分离组分复杂及含量低的样品,能将分离和浓缩合为一步,灵敏度高,检出限低,分析时间大大减少,是目前样品前处理最简捷、高效、灵活的一种手段。谭力等采用硅胶基质为固定相,分离检测血清总磷脂中脂肪酸含量,用固相萃取柱分离磷脂简单、快速、有效,回收率高,重复性好。3.2色谱色谱柱的选择被提取的脂质混合物可以采用吸附色谱方法进行分级分离。利用待分离组分在固定相间的吸附,分配系数的不同,离子交换平衡值的区别来进行分离。常用的是硅胶柱吸附层析,硅胶价格低廉,分离重复性好,可以再生。它可以把脂质分成非极性、极性和荷电的多个组分,然后分别收集各个组分,再在不同的系统中层析,可以分离单个脂质组分。如磷脂可分离成鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等。还可以使用氧化铝和离子交换树脂作为吸附剂,但目前研究较少,有待开发。总之,吸附色谱方法设备要求低,操作简单,生产成本低,能够用于大规模生产,也成为了研究的热点。缺点是操作过程中采用有机溶剂进行洗脱,回收困难,环境污染严重。随着分离分析设备的发展,近年来多采用液相层析与质谱联用的方法在1次试验中实现脂质的分离和鉴定。3.3脂质分析技术随着分析技术的发展,脂质的分析方法也得到了巨大的改进。总的来说,大多数的分析技术都可以用来分析脂质,包括:脂肪酸类、甘油脂类、鞘脂类、固醇脂类等。目前应用于脂质的分析鉴定的主要方法如下。3.3.1tlc分离脂质法TLC法也叫纸色谱法,是最早应用于脂质分析的方法。它具有直观,方便快捷的优点,操作简单,能够快速分离脂质,而且成本较低。但是TLC法也有它的缺点,样品前处理繁琐,所需的样品量大,灵敏度和分辨率低,很难实现自动化。显色反应也易受杂质的影响,而且TLC板上的斑点在切除过程中极易发生氧化,导致脂质的结构受到破坏。因此,在脂质代谢组学中它常作为补充及辅助的方法。3.3.2流动相的选择常用于脂质分析的有高效液相色谱芯片质谱联用(HPLC/Chip/MS)法、超高液相色谱质谱联用(UPLC/MS)法以及液相色谱飞行时间质谱联用(LC/TOF/MS)法。选择合适的流动相,能使样品不受杂质干扰而得到较好的分离。Minkler等采用改良的高效液相色谱-气质联用方法即反相离子对高效液相色谱-气质联用法,分析和阐明了不同动物(牛、大鼠、小鼠、狗)心磷脂分子的种类和特征,结果发现,不同动物的心磷脂中的2个分子量相同,但色谱保留时间不同,其脂肪酸的组成存在差异[分别由2个(C18∶2)、2个(C18∶1)、3个(C18∶2)、1个(C18∶0)所组成。3.3.3谱前鉴定的特点分析对象是气体和可挥发物质。气相色谱-质谱联用既具有气相色谱高分离效能,又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可同时达到定性定量的检测目的。还具有准确、灵敏度高,而且单次可测定多种成分等优点。尽管色谱法灵敏且准确,但需要对样品进行前处理,成本较高,而且所需仪器设备昂贵而笨重,需要专业人员维护,目前在国内尚未得到广泛应用。3.3.4esi/ms技术软电离质谱技术是20世纪80年代末期发展起来的质谱技术,包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI/TOF/MS)和ESI/MS,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI/TOF/MS)技术首先用脉冲激光将基质分子电离,同时将目的样品分子气化,在气相中基质分子将质子转移到样品分子上,使脂质分子带有1个电荷,在强电场的作用下加速获得动能,然后精确测定不同脂质到达TOF质量分析器的时间,从而进行质谱分析。ESI/MS技术是样品分子离子化时,可以保留整个分子的完整性,不会产生碎片离子,在目的样品离子化过程中,使样品溶液形成了带电的雾滴,再被加热到使溶剂蒸发,脂质分子形成气相的离子进行质谱分析,是目前应用最多的软电离质谱技术。由于这些电离方式对样品的破坏性小,所需样品少,分子量测定准确,质量测定范围大,对纯度不高的样品也能分析,而且很适合分析成分复杂的样品。3.3.5质谱分析法目前还有不少新技术被应用到脂质代谢组学中,如核磁共振(NMR)法、组织切片直接分析法、鸟枪法、纳米次级离子质谱(nanoSIMS)法以及荧光共振能量转移(FRET)等。3.4数据库lipodbs随着脂质代谢组学的迅速发展,脂质相关数据库也逐步建立。这些数据库提供了大部分脂质的有关信息,包括脂质命名、脂质分类、脂质结构、质谱信息、试验信息等。功能也越来越完善,这些数据库的建立推动脂质代谢组学自身的发展。其中最大的数据库LipidMaps,是2003年由美国国立综合医学研究机构(NationalInstituteofGeneralmedicalSciences,NIGMS)启动的“脂质代谢物和代谢途径研究策略”项目的研究成果,可以鉴定168万种脂类,除了包含了8000余种单一脂质的结构信息外,可以提供大量脂质的结构信息,还包括了81个大类、276个亚类脂质的结构信息。其他还有一些数据库如CyberlipidCenter、CyberLipids、GOLD、HumanMetabolome、KEGG、LipidBank、LipidLibrary、LipidMonsterDB、LMSAD、SOFA、SphinGOMAP等。4饲粮中氨基酸的代谢组学和生物组学目前,脂质代谢组学分析系统的软件、硬件技术都在进一步提高,正向着高通量、整合化、自动化的方向发展,使我们能快速地对脂质组实现自动化和可视化分析。近年来有很多应用脂质代谢组学技术的研究成果。Tan等利用靶向脂质代谢组学技术,从牛大脑中分离得到了50种新的内源性酰基氨基酸,这些氨基酸有激活G-蛋白耦联受体(如N-arachidonoylglycine,N-arachidonoylserine)、和激活瞬时受体电位通道(如N-arachidonoyldopamine,N-acyltaurines)等功效,这对于揭示某些小分子氨基酸在信号传导方面的重要功效具有很好的作用。Wood等采用脂质代谢组学技术,分析了饲粮中添加二十二碳六烯酸(DHA)对血液和大脑中内源性大麻素系统代谢产物改变的影响,结果表明,饲粮DHA具有影响N-酰基乙醇胺的合成和甘油酯代谢产物转化为DHA和二十碳五烯酸(EPA)的作用,为DHA在机体中的沉积和作用机理提供了合理的解释。而Ivanova等采用质谱脂质代谢组学技术在巨噬细胞中分离得到了多种少见或此前没有对其特性进行阐明的磷酯,包括带有醚键的磷酸肌醇(PIs)、磷脂酸、磷酸丝氨酸(PSs)、长链磷酸乙醇胺(PEs)、磷酸胆碱(PCs)及磷酸苏氨酸(PTs);另外还发现许多至少含1个奇数碳原子的磷脂。Velagapudi等采用脂质代谢组学技术,分析了消化道中微生物菌群可对小鼠血清代谢组、血清和脂肪组织脂质代谢组的影响,结果表明,能